KÉMIA


A kalmodulin és kismolekulás komplexei


Szerkezet alapú gyógyszertervezés

HARMAT VERONIKA, KARANCSINÉ MENYHÁRD DÓRA

A gyógyszertervezés a modern biokémia nagy kihívása. Kémikus szemmel nézve két eltérô megközelítése létezik ennek a problémának, a ligandum- és szerkezet alapú gyógyszertervezés. Az elsô a hatékonynak bizonyult molekulák szerkezetének általánosítását jelenti, a második a gyógyszermolekulával kölcsönható fehérje, ezen belül is az aktív hely szerkezetének ismeretét igényli. Ez utóbbi eljárás gyakrabban bizonyult sikeresnek, hiszen ha a fehérje- és a gyógyszermolekula komplexének térszerkezete ismert, a két molekula kölcsönhatásának részleteit is lehet tanulmányozni és értelmezni. Ebben nagy segítséget nyújt az utóbbi évtizedekben egyre inkább rutinszerûvé váló szerkezetvizsgáló módszerek mellett a számítógépes modellezés. A fehérjekrisztallográfiába és a számítógépes modellezésébe - az e területen leggyakrabban használt két módszerbe - szeretnénk betekintést nyújtani egy biológiailag sokszínû, szerkezetében igen dinamikus fehérje, a kalmodulin példáján.

A kalmodulin (CaM) több mint harmincféle enzim mûködését befolyásolja, többek között a sejtosztódás, a -növekedés, a -kiválasztás és az izom-összehúzódás szabályozásában vesz részt. Ez a kis méretû (148 aminosavból álló), kalciumkötô fehérje minden eukarióta sejtben megtalálható. A CaM különféle enzimekhez kötôdik, amikor külsô (hormonális) hatásra Ca2+ áramlik a sejtbe, amit ezáltal aktivál. A célenzimek szerkezetüket, funkciójukat, a kalmodulinkötô régióikat is tekintve igen különbözôek.

Röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálatok egész sora derítette fel, hogy van azonban egy általánosítható tulajdonsága e fehérjék kalmodulinnal képzett komplexeinek: a komplex a megfelelô enzimek kalmodulinkötô régióit bázikus amfifil-hélix formájában tartalmazza. Ez azt jelenti, hogy ezek a fehérje szakaszok olyan hélixet alkotnak, amelyek egyik oldalán hidrofób (apoláros, vízzel gyengén kölcsönható) a másik oldalon pedig pozitív töltésû aminosavak helyezkednek el. Mivel a CaM gátlásával sokféle folyamat befolyásolható, gátlószereit a gyógyászat különbözô területein használják.

A kalmodulin szerkezeti sajátságai

kalmodulinA CaM - biológiai sokszínûsége mellett - szerkezeti szempontból is igen érdekes, mert aktiválódása során meglepôen nagy szerkezeti változáson megy keresztül. Natív (alap) állapotában rendezetlen gomolyag szerkezetû, azonban - a már említett Ca2+-beáramlás hatására súlyzóhoz hasonló formát vesz fel - ez lesz a fehérje aktív állapota. A CaM 4 Ca2+-iont köt meg. Ezek az ionok a körülöttük kialakuló oktaéderes koordináció segítségével kimerevítik a fehérje két terminális régióját: az eredmény két, egymáshoz egy rendezetlen összekötô régióval kapcsolt, szinte teljesen azonos egység (domén) lesz, mely oldószer által könnyen megközelíthetô felületén hidrofób, körülöttük pedig savas aminosavak helyezkednek el. A CaM e nagy energiájú állapotából úgy képes szabadulni, hogy a közelben tartózkodó enzimek komplementer, tehát bázikus és hidrofób aminosavakat tartalmazó szakaszára a két hidrofób doménjével ráborul, miközben az összekötô régió meghajlik. A komplexálódás hatása tulajdonképp ennél határozottabb. A CaM a két hidrofób területtel mint két hatalmas manccsal megragad, és az enzimbôl kiemel egy megfelelô - ekkorra már helikális szerkezetû - szakaszt, amely az enzim belsô inhibítoraként funkcionált: elfedte az enzim aktív helyét. Ilyen módon aktiválja a célenzimeit, amelyek aztán különbözô folyamatok megindulását segítik elô.

1. ábra. A Ca2+-kalmodulin
4 TFP (trifluooerazin) molekulával
(szürke) és egy peptiddel (fekete)
alkotott komplexeinek szerkezete.
A fehérjének és a peptidnek
a gerinckonformációja látható,
amit szalagmodellel ábrázoltunk

A fehérje gátlószerei, a hidrofób és bázikus részleteket tartalmazó molekulák úgy hatnak, hogy a Ca2+-aktiválás után kialakult szerkezet hidrofób zsebeibe kötôdnek a CaM célenzimeivel versengve (1. ábra).

Módszerek és eredmények

A fehérjék térszerkezetének felderítésére két kísérleti módszer áll rendelkezésre: a nukleáris magrezonancia spektroszkópia (NMR) és a röntgendiffrakció. A CaM mûködése során bekövetkezô nagymértékû szerkezeti változásokat mindkét módszerrel behatóan tanulmányozták.

Az NMR spektroszkópia, amely az atommagok rádiófrekvenciás gerjesztésén alapuló szerkezetvizsgáló módszer, a molekulák oldatbeli szerkezetének meghatározására alkalmas. Hátránya azonban, hogy csak viszonylag kis méretû fehérjék tanulmányozását teszi lehetôvé.

A röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálat alapja, hogy a röntgensugárzás a vizsgált anyag kristályrácsában, a rácspontokon elhelyezkedô molekulák elektronfelhôjén szóródik, és az így nyert diffrakciós képbôl az elektronsûrûség-függvény számítható és az atomok helyzete meghatározható. A molekulaméret növekedése ennél a módszernél nem okoz gondot, de sok esetben nehézséget jelent a fehérjék kristályosítása, amely ma is gyakorlatilag próbálgatáson alapul.

A kristály elektronsûrûség térképe és a mért diffrakciós kép egymással bonyolult matematikai viszonyban van, azonban a diffrakciós képbôl a térszerkezetre jellemzô elektronsûrûség-függvényt matematikai mûvelettel közvetlenül nem kaphatjuk meg, mert a mérés során elveszik a szórt sugarak fázisára vonatkozó információ. Ez a krisztallográfiai fázisprobléma, melynek megoldására használható módszerek közül mi a molekuláris helyettesítést alkalmaztuk, amelynek során egy, az ismeretlen szerkezethez hasonló ismert szerkezetû modellmolekula (az irodalomban megtalálható egyik CaM komplex) helyzetét határoztuk meg a kristály elemi cellájában. Az optimálisan beállított modellbôl és a mért adatokból számított függvények átfedése maximális.

2. ábra. A FTP-molekula
beillesztése a differencia
elektronsûrûségi térképbe.
A differencia elektronsûrûségi
térképet szintfelületes
ábrázolásban szürkével,
a TFP és a fehérje atomjait
feketével ábrázoltuk

A szerkezetmeghatározás következô lépése a modellépítés, amelynek során a számítógéppel grafikusan megjelenített modell konformációját úgy módosítjuk, hogy illeszkedjen a mért intenzitások, a fázisok és a modellszerkezet segítségével számított elektronsûrûségi térképbe. Ekkor történik a modellben meg nem található részletek (pl. szubsztrát vagy gyógyszermolekulák) beillesztése is (2. ábra).

A modellépítés egyes szakaszait szerkezetfinomítási lépések követik: molekuladinamikai szimuláció (amelyet a késôbbiekben részletesebben jellemzünk) segítségével keressük a modellnek azt a konformációját, amely a mért adatoknak legjobban megfelel, és amellett egyes atomcsoportokon (aminosavakon) belül az atomok elhelyezkedése a lehetô legkisebb mértékben tér el a fehérjében általánosan tapasztalttól.

A röntgendiffrakcióval meghatározott szerkezettel kapcsolatban gyakran felvetôdik a kérdés, hogy a makromolekulának a kristályban fellépô többletkölcsönhatások miatt valamilyen mértékben torzult szerkezete mennyiben tükrözi a biológiai rendszerekben felvett konformációját, ez a torzulás azonban legtöbbször elhanyagolható.

A kalmodulint mindkét szerkezetvizsgáló módszerrel évek óta tanulmányozzák. Meghatározták a Ca2+-tartalmú fehérje komplexálatlan, valamint különbözô enzimek kalmodulinkötô régiójának megfelelô peptidekkel és egy gyógyszermolekulával, a trifluoperazinnal (TFP, 3. ábra) alkotott komplexeinek szerkezetét és a Ca2+-mentes kalmodulin konformációját is. Az NMR-spektroszkópiával és röntgendiffrakcióval meghatározott szerkezetek között az egyedüli különbség, hogy az NMR mérések mutattak rá igazából a Ca2+-CaM központi összekötô régiójának nagyfokú oldatfázisbeli rendezetlenségére.

3. ábra. A trifluoperazin (TFP, balra) és difenil-alkil-amin (DFA) molekulák szerkezeti képlete

A Náray-Szabó Gábor akadémikus vezette csoportunkban röntgendiffrakciós, valamint számítási módszerekkel vizsgáljuk a CaM különbözô típusú gátlószereivel alkotott komplexeit. (A kristályosítást szegedi kutatókkal együttmûködésben végezzük.) Célunk a CaM gyógyszermolekulákkal való kölcsönhatásának jobb megértése, valamint a ma ismert gyógyszermolekulák hatékonyságát növelô módosítások javaslata.

A kalmodulin gyógyszermolekulákkal való kölcsönhatását többféleképpen is el lehet képzelni. Feltételezhetô egyrészt, hogy a CaM hidrofób felszínén merev kötôhelyei vannak minden szubsztrát molekulának.

Sikerült CaM-TFP komplexet olyan oldatból kikristályosítanunk, amely a fehérjét és a gyógyszermolekulát fiziológiáshoz hasonló arányban tartalmazta. Az általunk meghatározott szerkezetben a korábban már felderített 4 TFP-kötôhely közül csak 2 volt betöltve, de azok a TFP-molekulát az ismerttel azonos konformációban tartalmazták. Ez az eredmény rávilágított arra, hogy az eddig feltételezettnél jóval kevesebb, 4 helyett valószínûleg csak 2 TFP molekula kötôdik a szervezetben a CaM-hoz. Ezen túl a CaM-2TFP szerkezet bizonyította, hogy a TFP-molekuláknak igen határozott kötôhelyei vannak a CaM felszínén.

Egy másik gyógyszermolekulával, egy difenil-alkil-amin származékkal (DFA, 3. ábra) kapcsolatos vizsgálataink jelentôsen eltérô eredményt szolgáltattak. A komplex egy kristálymódosulatában az találtuk, hogy a DFA molekula két különbözô, de egymással részben átfedô helyzetben kötôdhet a CaM-hoz, egy másik típusú kristályban (ahol a DFA pontos elhelyezkedését nem sikerült még meghatásozni) a fehérje két doménja kicsit más helyzetben van egymáshoz képest. Tehát míg a TFP-nek jól meghatározott, különálló kötôhelyei vannak a CaM-on, a DFA "csúszkáló ligandum", azaz kötôhelyei, hasonló kötôdési energiával rendelkeznek (tehát hasonló valószínûséggel töltôdnek be) és részben átfednek.

Eredményeinket a gyógyszertervezés szemszögébôl tekintve úgy összegezhetjük, hogy a TFP-molekula hatékonyságának növelése úgy képzelhetô el, ha kis változtatással sikerül a protonálható nitrogéneket tartalmazó részlete és a CaM hidrofób részét határoló savas aminosavak kölcsönhatását specifikusabbá tenni. Ezt eredményezhetné a TFP hidrofób részt és a töltést hordozó gyûrût összekötô szakaszának meghoszszabbítása. Vizsgálatainkból az is kitûnik, hogy a gyógyszermolekula hidrofób régióját is érintô változtatások (lásd DFA) a kötôhely, a kötési erô és specificitás megváltozását eredményezhetik, ezért ilyen típusú módosítások hatása kísérletek nélkül nehezen felmérhetô.

Számítógépes modellezés

Az eredmények értelmezéséhez és általánosításához a számítógépes modellezést hívtuk segítségül.

Egzakt kvantumkémiai számítások a molekulák mérete miatt kiterjedt biológiai rendszerekre nem alkalmazhatók. Biomolekulák konformáció analízisére ma az ún. erôteres módszerek a legelterjedtebbek. E módszerek a molekulákat merev gömbi atomokból építik fel, az atomokat rugókkal összekötve. Így a Hooke-törvény alakjával analóg energiatagok vezethetôk le.

E = 1/2 k (x-xo)2,

ahol k az erôállandó, x a rugó nyújtásának mértéke, xo az egyensúlyi (nyugalmi) rugóhossz. Több ilyen típusú energiatagot célszerû bevezetni (x: kötéstávolság -> kötés nyújtási energia, x: kötésszög -> hajlítási energia, x: torziós szög -> torziós energia...) amelyek összege a rendszer teljes energiája. A rugóállandók és az egyensúlyi geometriához tartozó paraméterek kis molekulákon elvégzett kvantumkémiai számításokból vagy kísérleti eredményekként állnak rendelkezésre. Így a rendszer Hooke-törvény alapján számított teljes energiája az általunk meghatározott belsô koordináták (kötéstávolság, kötésszög, torzió...) sokdimenziós koordinátarendszerében egy bonyolult potenciálfelszínt alkot, amelynek globális minimuma a molekula legkedvezoöb és egyúttal legvalószínûbb konformációját határozza meg. Konformációs analízisrôl akkor beszélhetünk, ha az általunk alkalmazott módszer a potenciálfelszín jelentôs részét "bejárja", azaz képes a felszín összetettsége miatt létezô nagyszámú lokális minimum mellett a globális minimum felderítésére is. Számos ilyen módszer létezik, itt csak az általunk is használt molekula-dinamika (MD) szimulációk alapelvét mutatjuk be. A MD-szimulációk során a molekula egyes atomjaira felírt newtoni mozgásegyenleteket integráljuk rövid idôközönként. Az egyes atomokra ható erôbôl számítjuk a megfelelô gyorsulásokat, amelyeket rövid idôtartamra állandónak tekintve meghatározzuk az atomok új helyzetét. Ha minden atom a reá ható erô eredôjének megfelelô elmozdulását elvégezte, akkor a teljes molekula egy új konformációja áll elô, a gradiensek (azaz az erô) újra számíthatók, és a következô idôlépés alatt bekövetkezô változás ismét jósolható. A szimulációt egészen addig folytatjuk, amíg az egy lépés alatt a rendszerben bekövetkezô változások kicsik lesznek és elvesztik tendenciózus jellegüket. Ekkor feltételezhetjük, hogy a globális minimum közvetlen környezetéhez tartozó konformációk seregét kapjuk.

A CaM-TFP komplex egy tisztán elméleti úton levezetett szerkezetét kiindulásul használva MD-szimulációkkal sikerült reprodukálnunk a TFP legerôsebb kötôhelyére vonatkozó röntgenkrisztallográfiai eredményeket. Ennek alapján úgy érezzük, hogy ez a módszer alkalmas lesz a TFP-molekula esetében javasolt módosítások hatásának elôzetes tesztelésére, valamint nehezen vagy egyáltalán nem kristályosítható komplexek számítógépes tanulmányozására.


Természet Világa, 128. évf. 10. sz. 1997. október, 469-471. o.
http://www.kfki.hu/chemonet/TermVil/
http://www.ch.bme.hu/chemonet/TermVil/


Vissza a tartalomjegyzékhez