KELLERMAYER MIKLÓS 
A mikroszkópos feloldási korlát áttörése 


„Hiszem, ha látom”, tartja a hétköznapi mondás és gondolkodásmód. Valóban, a látható érvek mindennél meggyőzőbbnek tűnnek. Nincs ez máshogy a természettudományokban sem. A természet, illetve a természet belső szerkezetének képekben való megjelenítése, vagyis leképezése hatékonyan járult hozzá működésének feltárásához, és forradalmasította a legtöbb tudományterületet. A fénymikroszkóp XVII. századi kifejlesztése és elterjedése óta (1. ábra) a modern fizika, kémia, biológia, anyagtudomány és orvostudomány elengedhetetlen eszközévé vált. 

1. ábra. a) Zacharias Jansen (1580–1638) holland szemüvegkészítő mester, az első összetett fénymikroszkóp megalkotója.1 b) Robert Hooke (1635–1703) angol természetfilozófus, a mikroszkópalkalmazás úttörője.2 c) Robert Hooke mikroszkópja. d) A parafa mikroszkópos képe, Robert Hooke rajza. A parafa sejtszerkezete (celluláris szerkezete) alapján nevezzük az élővilág legkisebb szerkezeti és működési egységét „sejtnek” 

A korai fénymikroszkópia azt sugallta, hogy a természet mikroszkopikus felépítésének megismerésében nem várhatók korlátok. A XIX. század végére azonban Ernst Abbé és Lord Rayleigh (2. ábra) munkásságának köszönhetően kiderült, hogy a fénymikroszkóp feloldóképességének elméleti korlátai vannak, vagyis a fénymikroszkóppal nem alkothatunk tetszőlegesen részletgazdag képet. 

2. ábra. a) Lord Rayleigh3 (1842– 1919) és b) Ernst Abbé4 (1840–1905) ismerték fel, hogy a fénymikroszkóp feloldóképességének elméleti korlátja van 

Az Abbé megfogalmazta híres képlet (1. egyenlet) közel másfél évszázadra áthághatatlan elméleti korlátot jelentett a mikroszkópos leképezés számára. A fénymikroszkópia technikai fejlődése alig néhány évtized alatt, 1900-ra már el is érte ezt az elméleti korlátot, amely így gyakorlati korláttá is vált. Jóllehet a XX. században számos próbálkozás történt az Abbé-féle feloldási határ megerőszakolására vagy megkerülésére, alapvető elméleti és gyakorlati áttörést csak az utóbbi mintegy másfél évtized kutatási és fejlesztési munkája eredményezett. Nem véletlen és légből kapott tehát a Svéd Királyi Akadémia döntése, mely szerint a 2014. évi Nobel-díjat a másfél évszázados paradigma megváltoztatásáért adományozta.

A Svéd Királyi Akadémia 2014. október 8-án hirdette ki döntését a kémiai Nobel-díjról. Ennek értelmében 2014-ben a kémiai Nobel-díjban Eric Betzig, Stefan W. Hell és William E. Moerner részesültek a szuperfelbontású fluoreszcencia mikroszkópia kidolgozásáért (3. ábra). Vajon kik is ezek a tudósok, és mi az a szuperfelbontású fluoreszcencia mikroszkópia?

3. ábra. Eric Betzig, Stefan W. Hell William E. Moerner 
A 2014. évi kémiai Nobel-díj nyertesei5  

Eric Betzig amerikai állampolgár, 1960-ban született a Michigan állambeli Ann Arborban. Doktori fokozatát 1988-ban szerezte a Cornell Egyetemen. Már ekkor a feloldási határ leküzdése érdekelte, és a közeli mező fizikájával foglalkozott. A New Jersey állambeli Murray Hill AT&T Bell Laboratóriumban a közeli mező pásztázó fénymikroszkóp kifejlesztésében ért el jelentős eredményeket. 1993-ban elsőként alkotott nagyfelbontású képet egyedi fluoreszcens molekulákról szobahőmérsékleten. Később felismerte a fényaktiválható fluoreszcens fehérjemolekulákban rejlő lehetőségeket, így jutott el a PALM mikroszkópia (photoactivation light microscopy) kifejlesztéséhez. 2005 óta a Howard Hughes Medical Institutes Janelia Farm intézményében csoportvezető. Stefan W. Hell német állampolgár, 1962-ben született Aradon. Doktori fokozatát 1990-ben szerezte a Heidelbergi Egyetemen. 1993 és 1996 között a finnországi Turkui Egyetemen dolgozott, ahol lefektette a STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia elméleti alapjait. 1997-től a Max Planck Intézet (Biofizikai Kémia, Heidelberg) munkatársa, majd igazgatója, ahol a STED mikroszkópia megépítését, továbbfejlesztését és számos alkalmazását valósította meg. William E. Moerner amerikai állam-polgár, 1953-ban született a kaliforniai Pleasantonban. Doktori fokozatát 1982-ben szerezte a Cornell Egyetemen. 1989-ben elsőként mérte meg egyetlen, mélyfagyasztott kondenzátumban csapdázott molekula abszorpciós spektrumát. 1997-ben megfigyelte, hogy a zöld fluoreszcens fehérjemolekula (GFP, green fluorescent protein) pislog, azaz véletlenszerűen kialszik (sötét állapotba kerül), majd visszatér fluoreszcenciája. Ugyancsak kimutatta, hogy a GFP-t egy rövid hullámhosszú fénnyel valómegvilágítással irányítottan is ki lehet hozni sötét állapotából. Később ez a megfigyelés vált a lokalizációs mikroszkópiák alapjává.

Szuperfelbontású fluoreszcencia mikroszkópia 

A szuperfelbontású fluoreszcencia mikroszkópia jelentősége abban rejlik, hogy mintegy megerőszakolja az immár közel másfél évszázados elméleti és gyakorlati optikai feloldási határt, és nanométeres, molekuláris feloldást tesz lehetővé. A XIX. században Ernst Abbé (1873) és Lord Rayleigh (1896) ismerték fel, hogy hullámelhajlási, azaz diffrakciós okok miatt egy tárgyról hullámok, például fény segítségével alkotott kép nem lehet tetszőlegesen részletgazdag. Ennek oka az, hogy egy pontszerű tárgy (mint egy optikai rács pontja vagy egy pontszerű fényforrás) képe kiszélesedett folt, úgynevezett elhajlási korong (4a. ábra). Ha a tárgypontok az elhajlási korong méreténél közelebb kerülnek egymáshoz, akkor a képeik alapján nem különíthetők el (4b. ábra). A mikroszkópos feloldásnak tehát elméleti és gyakorlati határa van (dmin), és ez a feloldási határ az alkalmazott hullám hosszával (l) összemérhető: 

ahol n az optikai közeg törésmutatója, a pedig a leképező rendszer nyílásszöge. A feloldási határ látható fény, azaz a fénymikroszkópia esetében 0,2 mm-nek adódik. Ilyen feloldással sejtorganellumok még vizsgálhatók, de ennél kisebb képletek, például vírusrészecskék és egyedi molekulák már nem különíthetők el egy bonyolult sokaságban (5. ábra). 

4. ábra. A fénymikroszkópos feloldási határ problémája. a) Az elhajlási korong. b) Képpontok átfedése és összemosódása a feloldási határon belül elhelyezkedő tárgypontok esetén 

5. ábra. Az Abbé-féle mikroszkópos feloldási határ illusztrálása a biológiai struktúrák hierarchiájában5 

6. ábra. a) Ernst Ruska (1906–1988) német kutató, az első elektronmikroszkóp megalkotója. b) Gerd Binnig (1947–) német és Heinrich Rohrer (1933–2013) svájci kutatók, a pásztázó tűszondás mikroszkópok kifejlesztői6

A XX. században számos erőfeszítés történt arra, hogy a feloldási határt valamilyen módon áttörjük. Az Ernst Ruska (6a. ábra) által az 1930-as években kifejlesztett elektronmikroszkópban például a rendkívül kis hullámhossz miatt jelentősen jobb, akár atomi feloldás érhető el. Biológiai minták esetében azonban az elektronmikroszkóp alkalmazásának rengeteg hátránya van a szükségszerű mintafixálás, dehidrálás és speciális festési eljárások miatt. Elektronmikroszkópban élő sejtek egyáltalán nem vizsgálhatók, és a fixált sejteken a molekuláris képletek fajlagos, specifikus megjelölése különleges módszereket igényel. A Gerd Binnig és Heinrich Rohrer ( 6b. ábra) által kifejlesztett pásztázó tűszondás mikroszkópiában teljesen új alapokra helyeződik a mikroszkópos képalkotás, ugyanis nem hullámelhajlás alapján alkotunk képet, hanem egy hegyes tűvel tapogatjuk le a minta felületét. A pásztázó tűszondás mikroszkópok feloldását így nem az alkalmazott hullám hossza, hanem a letapogató szonda görbületi sugara korlátozza, és akár atomi felbontás érhető el. Mivel azonban a képet felületi letapogatással nyerjük, a minta belső szerkezetét nem tudjuk feltárni. Az első pásztázó tűszondás mikroszkóp a pásztázó alagúteffektus mikroszkóp volt, de ezt nem sokkal követte az atomerőmikroszkóp kifejlesztése. Érdekesség, hogy Ernst Ruska, Gerd Binnig és Heinrich Rohrer ugyanazon alkalommal, 1986-ban fizikai Nobel-díjban részesült. 

Az Abbé-féle fénymikroszkópos feloldási korlát leküzdésében igazán jelentős áttörést az idei Nobel-díjasok munkássága hozott. A 2014. évi kémiai Nobel-díj hátterében voltaképpen három fontos felfedezés és fejlesztés húzódik: a) szuperfelbontású fluorofór-sokaság mikroszkópia, b) egyedi molekula fluoreszcencia spektroszkópia, és c) szuperfelbontású egyedi fluorofór mikroszkópia. Mindegyikben közös a fluoreszcencia jelensége. A fluoreszcencia fénykibocsátással járó relaxációs folyamat, amely során egy gerjesztett állapotú molekuláris rendszer visszatér alap energiaállapotába (7a. ábra). A gerjesztés hagyományosan nagyenergiájú (rövid hullámhosszú) fénynyel történik, bár egyéb fizikai és kémiai gerjesztési mechanizmusok is léteznek. A relaxáció során kibocsátott fény hullámhossza nagyobb, mint a gerjesztő fényé (például kék gerjesztő fény esetén zöld a kibocsátott fény). Fluoreszcenciára alkalmas festékmolekulák a fluorofórok, amelyek között találunk nagyszámú szerves kismolekulát és fehérjéket is. A fluoreszcens fehérjék archetípusa a zöld fluoreszcens fehérje (GFP), amelyet genetikai módosítással célszervezetekbe juttathatunk (7b. ábra). Mára a fluoreszcens fehérjék széles arzenálja áll rendelkezésre, melyek segítségével élő sejtek belsejében követhetők a biomolekuláris kölcsönhatások és fejlődéstani folyamatok.  

7. ábra. a) A fluoreszcencia jelensége egy molekuláris rendszer energetikai sémáján bemutatva.7 b) Zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) a szöveteiben kifejező nude (meztelen) egér természetes megvilágításban (felső kép) és kék gerjesztő fényben (alsó kép)8


  Szuperfelbontású fluorofór-sokaság mikroszkópia

A szuperfelbontású fluorofór-sokaság mikroszkópia alapja Stefan W. Hell azon felismerése, hogy egy diffrakciólimitált fókuszpont által gerjesztett molekulasokaság, amelynek kiterjedését tehát az elhajlási korong határozza meg, mérete csökkenthető úgy, hogy a fókuszpont szélein elhelyezkedő gerjesztett állapotú molekulákat stimulált emisszió segítségével mintegy kimerítjük, kioltjuk, vagyis depletáljuk. Mindezt úgy lehet megvalósítani, hogy a gerjesztő fénynyalábra azzal koncentrikus, gyűrű alakú kioltó fénynyalábot vetítünk (8. ábra). Ez tehát a STED mikroszkópia alapja. A kioltó fény intenzitásának (J) növelésével elméletileg korlátlanul csökkenthető feloldási határ:

ahol Js a gerjesztő fény intenzitása. A gyakorlatban szuperponált gerjesztő és kioltó lézernyaláb pásztázza végig a mintát pontról pontra, és az így csökkentett méretű gerjesztési térfogatból összegyűjtött fénypontokból rekonstruálódik a nanométeres feloldású kép. Mivel a leképezés pásztázó lézernyalábbal történik, a STED mikroszkópban eleve adott egy konfokális mikroszkóp, mellyel a vizsgálandó területről előzetes képet alkothatunk (9a. ábra). STED mikroszkópiás munkaállomást a Leica Microsystems gyárt és forgalmaz (9b. ábra). 

8. ábra. A STED mikroszkópia alapja. Betétábra: a kioltó
(vörös) fény intenzitásának növelésével csökken a gerjesztési
térfogat (zöld)5

9. ábra. a) Fluoreszcensen megjelölt mikrotubuláris rendszer konfokális, illetve STED mikroszkópos képe.9 b) A Leica Microsystems STED mikroszkópos munkaállomása10

Egyedi molekula fluoreszcencia spektroszkópia

Kémiai tudásunk nagy része olyan kísérletekből származik, amelyekben molekulasokaságot vizsgálunk, mint például egy kémcsőnyi vagy küvettányi vegyületet egy spektroszkópiás mérés során. Hatalmas előrelépést jelentett a W.E. Moerner által elindított egyedi molekula fluoreszcencia spektroszkópia, amely kísérletesen is rámutatott az egyedi molekulák szintjén megnyilvánuló sztochasztikus, véletlenszerű jelenségekre és folyamatokra, mint például a fluoreszcens festékmolekulák pislogása (blinking) (10a. ábra). 

10. ábra. a) Egyedi fluorofórmolekula pislogása, véletlenszerű ingadozása egy fluoreszkáló és egy sötét állapot között, állandó gerjesztő megvilágítás során.11 A fotokifehéredési lépéssel a fluorofór végérvényesen a sötét állapotba kerül. b) A GFP-molekula kapcsolásszerűen visszahozható a sötét állapotból 405 nm-es aktiváló fénnyel (páros képkockák)12

Az egyedi molekula fluoreszcencia mára szinte önálló tudományterületté nőtte ki magát. Segítségével egyedi molekulák biofizikai viselkedése követhető, és olyan folyamatok mechanizmusait fedhetjük fel és érthetjük meg, amelyek a molekulasokaság vizsgálata során rejtve maradnak. W. E. Moerner 1997-ben felfedezte, hogy bár a 488 nanométeres fénnyel gerjeszthető GFP-molekula egy idő után kiég, és sötét állapotba kerül, 405 nanométeres fén.nyel ismét aktiválható (10b. ábra). Ez a jelenség azt a lehetőséget hordozza, hogy egy fluoreszcens molekula állapotát tetszés szerint tudjuk megváltoztatni, vagyis kiés bekapcsolhatjuk. Eric Betzig 1995-ben azt az elméleti lehetőséget vetette fel, hogy ha az egyedi molekulák közötti távolság nagyobb, mint 0,2 µm, azaz a molekulák a feloldási határon kívül helyezkednek el, akkor pozíciójukat sokkal pontosabban meghatározhatjuk, mint a feloldási határ. Sőt, ha a molekulák egymástól eltérő tulajdonságúak, például különböző színűek, akkor a pozíciójukat még olyan esetben is pontosan meghatározhatjuk, ha egymáshoz közel helyezkednek el. Ekkor arra van szükség, hogy egymás után két különböző képet alkossunk, amelyek mindegyikén csak az egyik molekula látszik. Csak jóval később, 2005-ben jött rá, hogy az elkülönítendő molekuláknak nem is kell különböző színűeknek lenni; az is elegendő, ha időben máskor fluoreszkálnak.

11. ábra. A PALM mikroszkópia alapja. a) Egy fluoreszcens molekula pozíciójának meghatározása. b) Képrekonstrukció a PALM mikroszkópiában5

Mindez megvalósítható úgy, hogy először az egyik molekulát bekapcsoljuk, majd kikapcsolása után a másikat kapcsoljuk be. A lényeg, hogy egyetlen képpont feltétlenül csak egyetlen fluoreszcens molekulát tartalmazzon. A fluoreszcencia-aktiválás alapján kidolgozott mikroszkópia a PALM (11. ábra). 
Szuperfelbontású egyedi fluorofór mikroszkópia A feloldóképesség növekedésének alapja az, hogy a molekula képére kétdimenziós Gauss-görbe illeszthető, amelynek középpontja a fotonszám (N) függvényében pontosabban kiszámítható, mint az intenzitásprofil félérték-szélessége: 
A gyakorlatban ismétlődő foto aktivációs és fotokifehérítési ciklusok során gyűjtjük a fénypontadatokat, amely alapján nanométeres feloldású szuperkép kiszámítására kerül sor (11. ábra). 

12. ábra. Fluoreszcens fehérjével (kaede) konjugált lizoszomális
transzmembrán-fehérje (CD63) COS7 sejtben hagyományos (bal oldal) és
PALM mikroszkópos felvételen (középső és jobb oldal)13

A PALM-mal rokon módszer a STORM (stochastic optical reconstruction micro scopy). A PALM segítségével jelenleg néhány nanométeres feloldás érhető el az XY-síkban, amely rendkívül látványos részletgazdagság-növekedést eredményez mikroszkópos felvételeken (12. ábra). Mivel azonban az adatgyűjtés rendkívül időigényes, hiszen aktivációs és fotokifehérítési ciklusok sorozatával készül egy-egy felvétel, jelenleg fixált mintákon történnek a mikroszkópos vizsgálatok, és ekkor is különösen kell ügyelni arra, hogy a minta térben ne tolódjon el (például termikus okok miatt). A szuperfelbontású mikroszkópiák története alig néhány évre tekint viszsza, de a közel másfél évszázada fennálló mikroszkópos feloldási határ áttörésével jelentős paradigmaváltást idéztek elő. A segítségükkel útnak indult nanoszkópia különleges bepillantást enged a természet molekuláris dimenziójú felépítésébe és működésébe. A módszer további fejlesztésének legfontosabb irányvonalait a háromdimenziós szuperrezolúció és képrekonstrukció, az élő sejtekben történő mérések lehetősége, illetve a valós idejű videofelvételek jelentik. Nem fér hozzá kétség, hogy a nanoszkópia további fejlődésével az élő sejt működéséről valóban látványos felfedezéseknek leszünk tanúi. 

Hivatkozások 
1. http://www.history-of-the-microscope.org/ hans-and-zacharias-jansen-microscope-history.php 
2. http://en.wikipedia.org/wiki/Robert_Hooke 
3. http://en.wikipedia.org/wiki/John_William_ Strutt,_3rd_Baron_Rayleigh 
4. http://www.mikroskopie.de/pfad/bildentstehung/ eins.html 
5. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/ chemistry/laureates/2014/ 
6. http://www.nobelprize. org/nobel_prizes/physics/ laureates/1986/ 
7. Damjanovich S., Fidy J., Szöllősi J. Or- vosi biofizika. Medicina Könyvkiadó Zrt, Buda- pest, 2007. 
8. Hoffman, R.M. Imaging in mice with fluorescent proteins: from macro to subcellular. Sensors 8, 1157-1173, 2008. 
9. http://www.abberior. com/products/productlist/ cat/sted-resolft/prod/ abberior-star-635/ 
10. http://www.leica- m i c r o s y s t e m s . c o m / discoversuperres/ 
11. Xie, S., Trautman, J.K. Optical studies of single molecules at room temperature. Annu. Rev. Phys. Chem. 49, 441- 480, 1998. 
12. Dickson, R.M., Cubitt, A.B., Tsien, R.Y., Moerner, W.E. On/off blinking and switching behavior of single molecules of green fluorescent protein. Nature 388, 355- 358, 1997. 
13. Betzig, E., Patterson, G.H., Sougrat, R., Lindwasser, O.W., Olenych, S., Bonifacio, J.S., Davidson, M.W., Lippincott- Schwartz, J., Hess, H.F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science 313, 1642- 1645, 2006.


Természet Világa, 146. évfolyam, 2. szám, 2015. február
http//www.termeszetvilaga.hu/