Lendvai Balázs
Kétfoton pásztázó lézermikroszkópia

Modern képalkotó eljárások a gyógyszerhatások vizsgálatában


A tudományos kutatás hagyományos technikái az idegrendszer kutatásának változatos megközelítését segítik elő: az idegsejtek legapróbb részletei, a szinapszisok, illetve a milliméter ezredrészét kitöltő apró kitüremkedések, a dendrittüskék kitűnően vizsgálhatók a fixált szövetekben az anatómia hagyományos módszereivel, míg a sejtek membránjaiban elhelyezkedő ioncsatornák működését, az élő sejt ingerelhetőségi állapotait vizsgálja a klasszikus élettan. A neurofarmakológia - ezeknek a tudományoknak egy speciális alkalmazásaként - a hatásban szerepet játszó receptorokat azonosítja. Régi óhaj, hogy a fenti lehetőségeket - tehát a funkció megismerését a legkisebb anatómiai működési egységekben - egyazon vizsgáló eljárásban egyesíthessük. Ezért mondható, hogy a gyógyszerkutatás "forradalmasítását" jelenti a kétfoton pásztázó lézermikroszkópia (kétfoton-mikroszkópia a továbbiakban) az idegtudományok területén, mivel egy lépésben kombinálja a struktúra és a működés vizsgálatát. A 90-es évek közepétől jelentek meg a nemzetközi tudományos irodalomban az idegi működést kétfoton-mik-roszkópia segítségével vizsgáló közlemények. Hazánkban az MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézetében (és egyben elsőként a közép-európai régióban) Vizi E. Szilveszter kezdeményezésére és támogatásával épült meg az első ilyen készülék 2001-ben.

Miért olyan nagy jelentőségű ez a lépés az alapkutatás szempontjából? A kétfoton-mikroszkópia lehetővé teszi, hogy feltérképezzük az idegsejt különböző részein elhelyezkedő jelfogók (receptorok) hatásait és meghatározzuk, hogy egy adott gyógyszermolekula mely sejteket, mely részükön, milyen időbeni felbontásban aktivál vagy gátol, ami azért kulcsfontosságú, mert így ítélhető meg legpontosabban egy adott gyógyszer ideghálózatban kifejtett hatása. Ez utóbbi pedig ma már a gyógyszerkutatások egyik legfontosabb célkitűzése: a nem teljesen feltárt hatásmechanizmus akár ígéretes és hatékony szerek forgalomba hozását nehezíti - vagy adott esetben akadályozza meg - mind a hazai, mind a nemzetközi piacon.

Az eljárás nyújtotta lehetőségek

A mérés újszerűsége abban rejlik, hogy a gerjesztő lézersugár kizárólag egy kb. 0,3 µm átmérőjű és 0,1 femtoliter térfogatú fokális pontban éri el a vizsgálni kívánt anyagot, ezért két, ugyanazon időintervallumban beeső foton energiája egyesül és hozza létre a sejtekbe bejuttatott fluoreszcens indikátor gerjesztését, ami egyébként csak rövidebb hullámhosszúságú, nagy energiatartalmú fotonokkal lenne lehetséges (Denk és mtsai, 1990, 1995). A kétfoton-gerjesztés nem érinti a minta fokális ponton kívül eső részeit, így több nagyságrenddel csökkenti a sejtpusztító hatásokat, amelyek idáig limitáltak a lézersugárral végzett funkcionális vizsgálatokat. Ennek a jelentőségét felmérhetjük, ha eszünkbe idézzük, hogy a sebészet a lézereket késként használja a szövetek vágásához, pusztításához. Nem kis technikai kihívást jelentett olyan lézerrendszer megalkotása, amely rendelkezik a lézersugár optikai alkalmazásához fontos tulajdonságaival, de nem pusztítja el az élő szövetet. Mindez femtoszekundum pulzushosszúságú, ún. "mode-lock" lézer használatával lehetséges, amely a pulzusok ideje alatt a kétfoton-gerjesztéshez szükséges igen nagy fotonfluxust képes előállítani, ugyanakkor a két pulzus között eltelt nanoszekundumos idő alatt "alszik", amivel az átlagos energiaközlés rendkívül alacsony szinten tartható (Denk és Svoboda, 1997). Mivel a fluoreszkáló indikátorok gerjesztése többnyire a 350-550 nanométeres hullámhossztartományba esik és megközelítőleg kétszeres hullámhosszúságú fotonok energiája szükséges a kétfoton-effektushoz, ezek a lézerek az infravörös tartományban sugároznak (1. ábra).

1. ábra.  A kétfoton pásztázó lézermikroszkóp sematikus ábrázolása ((balra). A lézersugár pulzálva adja le az energiáját, így gerjesztés kizárólag a pulzusok időtartama idején jöhet létre. A lézer által kiváltott kétfoton-gerjesztés sematikus bemutatása (jobbra fent). A fiziológiás pufferoldat teremt direkt kontaktust az agyszelet és az objektív között Az idegsejteket elektróddal szúrják meg, amelynek fluoreszkáló festéktartalma így bejut a sejt belső terébe. A lézersugár a festéket kizárólag a fokális pontban, egy tojás alakú térben gerjeszti. Kérgi piramissejt kétfoton-mikroszkópos képe (jobbra lent). A jól feltöltött sejten a nyúlványok kitüremkedései, a tüskék és az axonok tágulatai, a varikozitások is vizsgálhatóak


In vivo, előaltatott állatban is lehetséges az idegsejtek ionmozgásainak és ezek gyógyszeres befolyásolásának tanulmányozása az agykéregben, akár 400 µm mélyen is (Svoboda és mtsai, 1997, 1999). A jelenlegi technológiai lehetőségek mellett a - relatíve kicsiny károsító ha-tással és nagy feloldással jellemezhető - kétfoton-mikroszkópia a legalkalmasabb módszer az intakt agyműködés vizsgálatara. A funkcionális képalkotó módszerek között egyedülálló módon, a fluoreszkáló anyagok segítségével megjelenített sejtválaszokat eddig nem tapasztalt idő- és térbeni felbontásban figyelhetjük meg az akut vagy túlélő agyszeletekben - elsősorban a csekély fotokárosodás és az infravörös gerjesztés jobb szöveti penetrációja miatt.
Mik a kétfoton-gerjesztés előnyei?

A) Penetráció. Az infravörös fény mélyebben hatol be a szövetbe, így a felszíntől távolabb eső (és egészségesebb) sejteket képes láthatóvá tenni.

B) Fokális gerjesztés. A fokális ponton kívül nem jön létre gerjesztés, ami alacsonyabb hátteret eredményez és csökkenti a károsító elváltozásokat.

C) A fotonszóródás kihasználása. A sejtet megtöltő fluoreszkáló anyagból származó fotonok akkor is megmérhetőek, ha szóródást szenvednek a szöveten való áthaladáskor. (Ez utóbbi miatt a konfoká-lis mikroszkópokban a fluoreszcens szignál jelentős része veszik el.)

D) Hangolhatóság. A kétfoton-mikroszkópiához használatos "mode-lock" lézerek sajátosságai miatt a lézersugarat az aktuálisan sejtbe töltött fluoreszcens indikátornak optimális kimenő fényhullámhosszra lehet hangolni.

E) Időbeni felbontás. Az ún. line-scan módban a rendszer képes 2 milliszekundumonként mintát venni, így a vizsgált ionszintek (pl. kalcium) változását képes az elektrofiziológiai mérések időbeni felbontásának megfelelően követni. Például az akciós potenciált kísérő kalciummozgások kimutatása lehetővé válik az egyedi dendrittövis térbeli felbontásában.

A rendkívüli térbeli felbontás miatt nemcsak a fókuszsíkba eső részt tanulmányozhatjuk, hanem a teljes idegsejtet is, a maga háromdimenziós kiterjedésében (2. ábra). Az élő, altatott patkányokon a fluoreszcens indikátorral feltöltött kérgi piramissejtek ionmozgásai megjeleníthetőek, ami lehetővé teszi a különböző receptorra ható agonista/antagonista gyógyszerek pontos hatásának leírását a sejt nyúlványainak apró tüskéiben. A különböző kérgi területeken elhelyezkedő idegsejtek összehasonlítása is lehetséges ilyen módon (például a frontális, érző és mozgató kéreg esetében).

A berendezés

A kétfoton-technika elérhető a kereskedelmi forgalomban lévő berendezések vásárlásával is, azonban tekintettel a módszer újszerűségére, a hatékony alkalmazásához szükséges a fizikai-mérnöki tudományok közvetlen felhasználása is. A képalkotó berendezés két fő részből áll: egy pásztázó egységből (pásztázó tükrök), amely a lézerfényt vízszintesen és függőlegesen eltéríti (ez előállítja a kétdimenziós képet), valamint egy detektáló egységből, amely a fényérzékelő detektorok (fénymérők) adatait számítógépesen feldolgozza (1. ábra). A fénymikroszkóp is némi átalakításra szorul, az optikai útba beiktatott dikroikus tükrök bizonyos hullámhosszú fényt eltérítenek, mint egy tükör, más hullámhosszon viszont átengedik a fényt. Így a látható fényt, amelyet a sejtbe juttatott fluoreszkáló anyag ad ki magából, a dikroikus tükör a mikroszkóp objektívlencséje feletti fénymérőbe téríti, a fluoreszkáló anyagot gerjesztő infravörös fényt viszont átengedi, hogy elérje az agyszeletet (1. ábra). Hasonló elven működik az alsó fénydetektor is, csak ott a dikroikus tükör átengedi a sejtekből származó fényt a detektor felé. A vizsgálni kívánt sejt, amely az agyszeletben valamilyen magasságban helyezkedik el, a tér minden irányába küld (emittál) fluoreszcens gerjesztésből származó fotonokat. Mivel ezeknek a fotonoknak a száma arányos a kalciumszint változásával (minél magasabb a kalciumszint, annál több fotont ad le az anyag), a legcélszerűbb az lenne, ha a fénymérők gömbszerűen körülvennék a sejtet. Technikai okok miatt azonban a legcélravezetőbb egy alsó és egy felső fénydetektor alkalmazása. Az alsó esetében az emittált fotonoknak keresztül kell menniük a szelet alsóbb részein, ez bizonyos veszteséget jelent, amely a fotonokat leadó struktúra háromdimenziós helyzetétől függ. Az idegsejtek néha igen nagy, a vizsgált agyszeletben csaknem a teljes vertikális metszetre kiterjedő nyúlványhálózattal rendelkeznek. Mivel ezek a nyúlványok veszik fel túlnyomórészt a más sejtektől jövő ingereket és adják le ismét más sejtek felé, nem meglepő az állítás, hogy a kétfoton-mikroszkópia talán a legalkalmasabb jelenleg a sejtek funkcióinak a térbeli vizs-gálatához. A mindennapi kísérletekben patkányok vagy egerek agyszövetét élő, altatott állatban vagy posztmortem agyszelet-preparátumban lehet vizsgálni. A leggyakrabban a sejteket az elektrofiziológiai vizsgálatokban már régóta használt elektródos módszerrel töltik fel a fluoreszkáló anyaggal. A kísérletek során az elektród rátapad a sejtre, majd az elektród és a sejt belső tere között átjárást hoznak létre a sejt membránjának felszakításával, és így az elektródban lévő fluoreszkáló anyagok (leggyakrabban kalciumra érzékeny molekulák) bekerülnek a sejt belsejébe (1. ábra). Ennek eredményeként a gerjesztett fluoreszcencia mérésével az idegsejtek nyúlványrendszere 15-20 perc elteltével kirajzolódik. A kétfoton-mikroszkópos képeken a legapróbb elemi egységek: a nyúlványok (dendritek: a más sejtektől érkező információk fogadására - ezek a sejt adatbemenetét jelentik), a dendritek kitüremkedései, a tüskék és az axonok (a sejt más sejtek felé küldött nyúlványai - a kimenetek) varikózus tágulatai jól kivehetőek és bennük az élettani változások vizsgálhatóak (1-2. ábra).

2. ábra. EGFP fehérjét (Enhanced Green Fluorescent Protein) tartalmazó piramissejtek a patkány szomatoszenzoros kérgében élő, altatott állatban (fent; Lendvai és mtsai, 2000). Az fluoreszkáló fehérje génjét vírusok segítségével jutatták az állatok agyába. A sejteket a vírusvektor megfertőzte, így a fehérje bejutott a sejtekbe, és lézeres megvilágításra jelentős fényleadásra képes. Mikrométerenként lefele haladva és metszeteket készítve (lent), a dendritszakasz (fehér vízszintes nyíl) és kapcsolatainak finomabb részletei felnagyítva figyelhetőek meg. Jól kivehető egy axonrészlet is, amely a dendritet keresztezi (ferde nyíl). Az axon egyik tágulata, amely minden bizonnyal egy átvivőanyag-felszabadítási hely, a 3. és 4. kisméretű képen egészen közel kerül az egyik dendrittüskéhez; azon minden bizonnyal szinapszist képez (piros vízszintes nyíl)


Alkalmazási területek

A gyógyszerek hatásait vizsgáló kutatásokban az eddig alkalmazott ingerlési lehetőségek (elektromos téringerlés, kálium-kloridos stimuláció) rendkívül erős behatások, ezért komplex, számos sejten kialakuló és magasabb szinten összegződő hatást figyelhetünk meg. Ilyen magasabb szinten megjelenő hatás például az átvivőanyagok felszabadulása vagy akciós potenciálok képzése. De milyen mennyiségű gyógyszer elegendő az egyedi sejtek elemi egységeinek (tüske, axon) aktiválásához? Mi az elemi hatás, és hogyan összegződik a szomszédos egységek közötti kommunikáció során? Ezek olyan kérdések, amelyekre a kétfoton-vizsgálatok előtt nagyon kevés közvetlen információval rendelkeztünk, ugyanakkor ismeretük, megértésük nélkül a gyógyszerek hatásai nem térképezhetőek fel teljes mértékben.

A neurális integráció elemi egységeinek funkciói
A kétfoton-mikroszkópia egyik leggyakoribb alkalmazási területe a tüskés (elsősorban piramissejtekre jellemző) dendritnyúlványok vizsgálata. Az utóbbi idők vizsgálatai egyértelműen rámutattak arra, hogy a piramissejteken az elemi szinaptikus integrációt a dendrittövisek végzik (Yuste és Denk, 1995), ezért az itt megjelenő aktivitás egy-egy preszinaptikus axonvarikozitás izgalmának az eredménye. Ezek a kutatások feltárták, hogy a tüskék képesek a folyamatok egyidejűségének érzékelésére. Ha egy sejt aktív volt, és egy nagy potenciálváltozás terjedt szét az axonján, hogy más sejteknek üzenetet küldjön, ez az aktivitás végső soron eljut a dendrittüskébe is, és itt mint kalciumszint-emelkedés jelenik meg. Egy másik sejttől párhuzamosan (kis időablakon belül) beérkező információ a normálisnál jóval nagyobb kalciumválaszt vált ki a tüskében, ezzel megkülönböztetve a korábbi aktivitáshoz társuló bemenetet. Ez a jelenség lehet a memória és a tanulási folyamatok elemi szinten létrejövő alapja. Ezért a gyógyszermolekuláknak a tüske kalciummozgásokra gyakorolt hatása alapvető fontosságú a különböző mentális zavarokkal, agyi funkciók csökkenésével járó betegségekben, mint amilyen például az Alzheimer-kór. Ismert az is, hogy egy piramissejt dendrittüskéi nem teljesen homogének farmakológiai szempontból: vannak köztük olyanok, amelyek nem ionotrop glutamátreceptor-aktiválással működnek. Ezekben az esetekben a kétfoton-mikroszkópia választ adhat arra a kérdésre, hogy milyen más átvivőanyagoknak van szerepük az itt megjelenő információátvitelben. Ezek az ismeretek új terápiás támadáspontokat szolgáltathatnak a jövőben. Megérthetjük, hogy a noradrenalinnak mely receptora milyen aktiválási mintázat mellett képes a memóriafunkciókat hatékonyan javítani, s lerakhatók egy új farmakoterápia sejtszintű alapjai.

A neurális struktúra változásának követése
A metodika használatával elért eddigi eredmények szerint a neuronok dendritjein elhelyezkedő tüskék a normál idegműködés alatt is képesek alakjuk, méretük változtatására, sőt teljes mértékben felszívódhatnak egyes elemek és új tüskék is képződhetnek (Dailey és Smith, 1996; Fischer és mtsai, 1998; Chen és mtsai, 2000; Lendvai és mtsai, 2000, 3. ábra). A tapintási információ kiiktatása, azaz a patkányok ellenoldali bajuszszőreinek eltávolítása a tövisek strukturális dinamikájának csökkenését eredményezi a megfelelő agykérgi részben, így levonható a következtetés, hogy a tüskemorfológia változása fontos szerepet játszik az idegrendszer alkalmazkodási reakcióiban. Érdekes, hogy ezeknek a strukturális változásoknak az időkomponense meglepően gyors: adott esetben 10 perc elegendő egy tüske hosszának megkétszerezéséhez. Ugyanakkor idősebb állatokban a bajuszszőr eltávolítására adott reakció nem figyelhető meg, ami minden bizonnyal kapcsolatban van a patkányok tapasztalatokon alapuló plaszticitása esetében megfigyelt időablakkal. Ezek a kétfoton-vizsgálatok eloszlatták azt a korábbi meggyőződést, hogy az idegsejtek struktúrája statikus; a normál működés során csupán az egyéb élettani paramétereik (ionszintek) változnak.

3. ábra. Mesterségesen bejutatott fluoreszcens proteint tartalmazó dendritnyúlvány különböző időpontokban készített és egymásra fektetett kétfoton-mikroszkópos képe élő, altatott patkányban. A három különböző szín a megfelelő időpontokat jelöli. A fehér szín az állandó, alakjukat és méretüket nem változtató részeket mutatja. A kék/piros/zöld színek egy adott időpontban megjelenő részeket tárnak elénk. A sárga szín két időpontban is jelen lévő alkotórészeket jelez. A dendrittüskék változatos formákat és méreteket vesznek fel az eltelt egy óra során. A 60. percnél teljesen új nyúlvány (zöld) jelenik meg a dendritszakasz középső részén. 30 perc elteltével is megfigyelhetőek apró kinövések a már létező tüskék fejéből (piros)


A neuronok dendritjein elhelyezkedő tüskék tehát a normál idegműködés alatt is képesek alakjuk, méretük változtatására (3. ábra). A tüskék mozgása az életkor előrehaladtával csökken, de felnőtt állatban is kimutatható marad (Dunaevsky és mtsai, 1999). A dendritek eme strukturális dinamikai tulajdonsága a szinaptikus plaszticitás kialakulásakor képes változni, így a tartós megerősítés jelensége alatt, amelyet sokan a tanulás sejtszintű modelljeként tartanak számon, új tüskék képzése indul be (Maletic-Savatic és mtsai, 1999; Engert és Bonhoeffer, 1999). Felvetődik a kérdés, hogy az idegműködést elősegítő, de receptorhatással nem kellően megmagyarázott gyógyszerek esetében nem ez a dendritikus mechanizmus felelős-e a több ponton is megerősített pozitív humán hatásokért.

Farmakológiai vizsgálatok

Nootrop szerek vizsgálata a morfológiai plaszticitás megfigyelésével
A plasztikus morfológiai tulajdonságok kapcsolatban állhatnak az agyműködést általában elősegítő, ún. nootrop szerek hatásaival. A kétfoton-mikroszkópia felhasználható a központi idegrendszerre ható memóriajavító vegyületek kutatására is. A vinpocetin (ismert gyógyszerneve: Cavinton) esetében tapasztalt sejtszintű hatások sokfélesége (ioncsatorna- és receptorgátlásos hatások) magyarázatául talán éppen egy ilyen jellegű működés állhat: a recep-tív felület változtatásával a felszínen elhelyezkedő működési elemek összaktivi-tásában is minden bizonnyal komoly változások állnak be.

Ellentmondásosnak tűnik, hogy a sejtszintű tanulási mechanizmusokat a vinpocetin serkenti, ugyanakkor a membrán-ioncsatornák és -receptorok működését gátolja. A dendritben végbemenő strukturális átrendeződések eredményeként előfordulhat, hogy a szinaptikus felületre gyakorolt hatás input-specifikus, azaz csak az aktivált dendrittövisekre korlátozódik (ahova az adott bemenet érkezett), vagy éppen a nem aktivált tüskékre terjed ki, így a sejten megjelenő hatás finom beállítása javul, a szinaptikus "zaj" csökken, a szignál relatíve erősödik, ami feloldhatja a látszólagos ellentmondást. A kétfoton-kísérletekben a vinpocetin a sejtek dendritjeinek struktúráját jelentősen átrendezte (Lendvai és mtsai, 2003, 4. ábra). 90 perc elteltével számos új tüske, illetve már létező tüskék fejéből altüskék, ún. spinulák bújtak ki, amelyek irodalmi előzmények alapján az egyedi tüskék "tanulási" folyamata során jelennek meg (4. ábra).

4. ábra. Az idegsejtek nyúlványain elhelyezkedő kitüremkedések aktívan képesek mozogni a perces időskálán. Az ábra jobb oldalán egy agykérgi piramissejt fluoreszcens kétfoton-mikroszkópos képe látható posztmortem patkány agyszövetben. A négyzettel jelzett területet kinagyítva az ábra jobb felső részén mutatjuk be. A jobb alsó részen a nyúlvány egy kinagyított része látható a kitüremkedésekkel (dendrittüskékkel) a 0. és a 90. percben. A nyilak az alakjukat változtató kitüremkedéseket jelölik. Ezeknek a felszínén helyezkednek el a szinaptikus bemenetek és nemszinaptikus jelfogók


A nikotin hatásainak megfigyelése
Az agyi nikotinreceptorokat már kimutatták az axonterminálisok membránjában (Vizi és Lendvai, 1999), ahol ezek a recep-torok hatékonyan befolyásolják a szinaptikus transzmissziót (McGehee és mtsai, 1995, Gray és mtsai, 1996). Az egyik ni-kotinreceptor típus, az a7 receptor az idegrendszerben egyedülállóan magas kalciumátengedő képességgel rendelkezik. A kalciumszintet kimutató kétfoton-mikroszkópos alkalmazások ezért különösen hatékonyak a nikotin hatásainak felderítésekor. A nikotin sejteken lévő receptorainak aktiválását követően a sejt belseje felé irányuló ionáram jön létre. A Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet gyógyszertani laboratóriumaiban a striatumban és a hippokampuszban elhelyezkedő nikotinreceptorok noradrenalin-, szerotonin- és dopaminfelszabadulást befolyásoló hatását vizsgálták intenzíven az utóbbi évtizedekben (Vizi és mtsai, 1995, Sershen, 1997, Lendvai és mtsai, 1996). Érdekes módon a depresszió oldására használt gyógyszerek egy jelentős részénél találtak nikotinikus hatásmechanizmusra utaló jeleket (Hennings és mtsai, 1997). Újabb vizsgálatok szerint a különböző idegsejteken lévő, nikotint érzékelő receptorok befolyásolják a hippokampusz ideghálózatának működését normál körülmények között is. A humán nikotinreceptorok kló-nozása és funkcionális vizsgálata is megtörtént (Gopalakrishnan és mtsai, 1997), így az állatkísérletes eredmények az orvosi terápiában is nagy jelentőséggel bírnak. A nikotinreceptorok szerepét kimutatták a memória és a tanulás létrejöttében (Levin és mtsai, 1997) és a súlyos demenciával járó Alzheimer-kórban (Giacobini és mtsai, 1998). A nikotinikus funkciók kétfoton-mikroszkópos megfigyelése több új adatot is szolgáltatott. Normál állapotban a sejtek az idegi aktivitásra kalciumemelkedéssel válaszolnak a nyúlványokban. Nikotin jelenlétében a kalciumemelkedés az alaphelyzethez képest megnő, de nem minden nyúlványtüskében (5. ábra). Vagyis a nikotin a kalciumválaszokat összetett módon képes befolyásolni. Ha ez egyik tüskére fokozott választ tud előidézni, míg a másikra nem, könnyű elképzelni, hogy a nyúlványrendszer működési egységeiben, a tüskékben eltárolható bitinformáció mennyisége megnő. Ez a nikotin sejtszintű hatásmechanizmusára derít némi fényt, és további új adatokkal kiegészülve segíthet megérteni, hogy a nikotin pontosan milyen módon képes az emberekben a memória serkentésére.

5. ábra.  Piramissejtek bazális nyúlványaiból kitüremkedő tüskék heterogén kalciumregulációja. Az ábra bal felső részén látható egy hippokampuszban elhelyezkedő piramissejt kétfoton-mikroszkópos képe. A sárga négyzettel jelölt területet felnagyítva felbukkannak a dendrittüskék (balra lent). Két dendrittüskén keresztül fektetve a lézer pásztázó vonalát (1-2 tüske) a kalciumváltozást időben regisztráljuk (jobbra). A sejtet aktív működésre, akciós potenciál képzésére serkentve a tüskékben a kalciumszint megemelkedik (fekete görbék). Nikotin adására (piros görbék) az egyik tüskében megnő az akciós potenciálokra adott kalciumválasz. A nikotin elvonása után visszatér a normál aktivitás (szürke görbék)


Preszinaptikus gyógyszerhatások közvetlen megfigyelése
A kétfoton-mikroszkópia térbeli felbontása lehetővé teszi a rendkívül vékony, a legtöbb fluoreszcens képalkotó metodika számára láthatatlan axonterminálisok megfigyelését, a bennük végbemenő élettani változások követését (1-2. ábra). Amennyiben kalciumjelölő fluoreszkáló indikátorral töltjük fel a vizsgálni kívánt sejtet, különösen hasznos információkhoz juthatunk, hiszen az idegi átvivőanyagok felszabadulását, amelyek révén a terminális (illetve a sejt) más sejtekkel kommunikál, a kalciumszint emelkedése indítja be. Ha a varikozitások felszínén elhelyezkedő receptorok serkentő természetűek, a gyógyszerek beadása után Ca2+-szint emelést eredményezhetnek (ionátengedéssel vagy indirekt módon, a másodlagos hírvivő rendszerek aktiválása útján). A gátló hatású preszinaptikus moduláció valamilyen ingerlés, pl. elektromos téringerlés vagy pontszerű ingerlés által kiváltott Ca2+-válasz csökkentésén keresztül figyelhető meg. Ilyen kétfoton-vizsgálatok tárták fel, hogy egy, a mozgatórendszerben kulcsszerepet játszó idegpálya axonján, ahol számos, ezres nagyságrendbe eső átvivőanyag-felszabadítási hely (varikozi-tás) található, a felszabadulási helyek változatos módon tartalmaznak dopamin-receptor altípusokat: az egymás után elhelyezkedő terminálisok közül egyesek D1, mások D2 dopaminreceptorokat fejeznek ki, míg sok ilyen varikozitás egyáltalán nem tartalmazza ezeket a receptorokat (Mizuno és mtsai, 2005).

Szinaptikus és nem-szinaptikus transzmisszió - gyógyszerhatások
A dendritek kétfoton-képein jól elkülöníthető a két felület: a szinaptikus (töviseknek megfelelő) és a nem-szinaptikus (a tövisektől távol eső) dendritrészek, ezáltal a gyógyszerhatások is eltérően osztályozhatóak. A térbeli feloldás lehetővé teszi, hogy a szinaptikus és nem-szinaptikus Ca2+-válaszokat külön vizsgálhassuk és következtetéseket vonjunk le a megfelelő receptorok hatásmódjára. A nagy affinitású és könnyen elérhető nem-szinaptikus kötőhelyek a gyógyszerek elsődleges hatáspontjai az orvosi terápiában (Vizi és Lábos, 1991; Vizi, 2000).

Érdekes módon a kolinerg varikozitások alig 7 százaléka létesít szinaptikus kontaktust a hippokampuszban (Umbriaco és mtsai, 1995), így az acetilkolin főleg az extracelluláris térbe ürül (Descarries és mtsai, 1997) ami az agy térfogatának 20-25 százaléka (Vizi és Kiss, 1998). Az acetilkolin tehát a nem-szinaptikus transzmisszióban vesz részt. Nagyon valószínűnek tűnik, hogy - a jelenleg használt gyógy-szereink többségéhez hasonlóan - a szervezetbe bekerült nikotin ilyen módon éri el a receptorait a központi idegrendszerben. A szinaptikus hatások vizsgálata lehetséges az egyedi dendrittüskékben a kétfoton-mikroszkópia segítségével (Svo-boda és mtsai, 1996; Yuste és Denk, 1995): a tüskék kalciumdinamikája a szinapszis működését jellemzi. A nem-szinap-tikus transzmisszió igazolására a vizsgált sejtek háromdimenziós elektronmikroszkópos feldolgozását is el lehet végezni, ami megmutatja, hogy az aktivált dendritszakasz (nem tövis) szinapszisban volt-e. Így a gyógyszerek hatásmechanizmusairól jelentősen többet tudhatunk meg, mert közvetlenül lehetséges a hatás megfigyelése az idegi aktiválás elemi egységen, a dendrittövisen (Yuste és Denk, 1995). A nem-szinaptikus transzmisszió vizsgálatától várható eredmények jelentősége igen nagy, hiszen a jelenleg birtokunkban lévő gyógyszerek nagy részénél a hatás minden bizonnyal a nagy érzékenységű és a farmakonok számára könnyebben elérhető nem-szinaptikus receptorokon valósul meg (Vizi és Kiss, 1998).

IRODALOM
Dailey M. E., Smith S. J., The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci 16: 2983-94. (1996)
Denk W. and Svoboda K., Photon upmanship: why multiphoton imagingt is more than a gimmick. Neuron 18: 351-357. (1997)
Denk W, Stickler JH and Webb W, Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science 248: 73-76. (1990)
Denk, W. Piston, D. W. and Webb W.: Two-Photon molecular excitation in laser scanning microscopy. In:Handbook of Biological; Confocal Microscopy. Ed James B. Pawley. Plenum Press, NY (1995)
Descarries L., Gisiger V. and Steriade M., Diffuse transmission by acetylcholine in the CNS, Prog. Neurobiol. 53: 603-625. (1997)
Dunaevsky A., Tashiro A., Majewska A., Mason C., Yuste R., Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA 96: 13438-13443. (1999)
Engert F. and Bonhoeffer T., Dendritic spine changes associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature 399: 66-70. (1999)
Fischer M., Kaech S., Knutti D., Matus A., Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron 20: 847-854. (1998)
Giacobini E., Cholinesterase inhibitors for Alzheimer’s disease therapy: from tacrine to future applications, Neurochem. Int. 32: 413-419. (1998)
Gopalakrishnan M., Molinari E. J. and Sullivan J. P., Re-gulation of human a4b2 neuronal nicotinic acetylcholine receptors by cholinergic channel ligands and second messenger pathways, Mol. Pharmacol. 52: 524-534. (1997)
Gray R., Rajan A.S., Radcliffe K.A., Yakehiro M. and Dani J.A., Hippocampal synaptic transmission enhanced by low cooncentration of nicotine, Na-ture 383: 713-716. (1996)
Hennings E.C.P., Kiss J.P. and Vizi E. S., Nicotinic acetylcholine receptor antagonist effect of fluoxetine in rat hippocampal slices, Brain Res. 759: 292-294. (1997)
Lendvai B., Sershen H., Lajtha A., Baranyi M., Sántha E. and Vizi E.S., Differential mechanisms involved in the effect of nicotinic agonists DMPP and lobeline to release [3H]5-HT from rat hippocampal slices, Neuropharmacology 35: 1769-1777. (1996)
Lendvai B., Zelles, T., Rozsa B., and Vizi E.S., A vinca alkaloid enhances morphological dynamics of dendritic spines of neocortical layer 2/3 pyramidal cells. Brain Res. Bull. 59: 257-260. (2003)
Chen B., Lendvai B., Nimchinsky E., Burbach B., Fox K., Svoboda K., Imaging high-resolution structure of GFP-expressing neurons in neocortex in vivo, Learn. Memory 7: 433-441. (2000)
Lendvai B., Stern E., Chen B. and Svoboda K., Experience-dependent plasticity of dendritic spines and filopodia in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature 404: 876-881. (2000)
Levin E.D., Torry D., Christopher N.C., Yu X., Einstein G., Schwartz-Bloom R.D., Is binding to nicotinic acetylcholine and dopamine receptors related to working memory in rats? Brain Res. Bull. 43: 295-304. (1997)
Maletic-Savatic M, Malinow R, Svoboda K., Rapid dendritic morphogenesis in CA1 hippocampal dendrites induced by synaptic activity. Science 283: 1923-1927. (1999)
Mizuno T., Schmauss C., and Rayport S., Dopamine receptors responsible for the presynaptic modulation of striatal medium - spiny neuron synapses; two - photon Ca2+ imaging in knock - out mice. Program No. 34.13. (2005) Abstract Viewer/Itiner-ary Planner. Washington, DC: Society for Neuro-science.
McGehee D.S., Heath M.J.S., Gelber S., Devay P. and Role L.W., Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors, Science 269: 1692-1696. (1995)
Svoboda K, Denk W, Kleinfeld D and Tank DW, In vivo dendritic calcium calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature 385: 161-165. (1997)
Svoboda K, Helmchen F, Denk W, Tank DW.: Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci 2: 65-73. (1999)
Svoboda K, Tank DW, Denk W.: Direct measurement of coupling between dendritic spines and shafts. Science 272: 716-19. (1996)
Umbriaco D., Garcia S., Beaulieu C. and Descarries L., Relational features of acetylcholine, noradrenaline, serotonin and GABA axon terminals in the stratum radiatum of adult rat hippocampus (CA1), Hippocampus 5: 605-620. (1995)
Vizi E.S. and Kiss J.P., Neurochemistry and pharmacology of the major hippocampal transmitter systems: synaptic and nonsynaptic interactions, Hippocampus 8: 566-607. (1998)
Vizi E.S. and Lábos E., Nonsynaptic interactions at presynaptic level, Prog. Neurobiol. 37: 145-163. (1991)
Vizi E.S. and Lendvai B., Modulatory role of presynaptic nicotinic receptors in synaptic and nonsynaptic chemical communication in the central nervous system. Brain Res. Rev. 30: 219-235. (1999).
Vizi E.S., Role of high-affinity receptors and membrane transporters in nonsynaptic communication and drug action in the central nervous system. Pharmacol. Rev 52: 63-89. (2000)
Yuste, R. and Denk, W.: Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration. Nature 375: 682-684 (1995)


Természet Világa Idegtudomány különszám, 2006. december
http://www.termeszetvilaga.hu/
http://www.chemonet.hu/TermVil/