A sejtciklus motorjai és sebességváltói
Az élőlények növekedése, szaporodása, a szövetek állandó megújulása, sőt a vírusok sokasodása sem lehetséges a sejt örökítő anyagának megkettőzése és osztódása nélkül. A sejtosztódás, tehát az egyedek, következésképpen a földi élet fennmaradásának, terjedésének, és végső fokon evolúciójának is alapfeltétele. Az osztódó sejtpopulációban az anyasejt megkettőződését egy előkészítő szakasz követi, s csak ezután indul meg leánysejtjeik osztódása. Ez a periodikusan ismétlődő folyamat a sejtciklus. A sejtciklus regulációja a szervezet növekedés-szabályozásának sejtszintű alapja. A ciklusszabályozás hibái vagy a sejt pusztulását okozzák, vagy korlátlan növekedéshez, végső fokon rosszindulatú daganatos elfajuláshoz vezetnek.
A 2001. évi Orvosi Nobel-díj kitüntetettjei
a sejtciklus sejten belüli szabályozó molekuláinak, a ciklineknek és a ciklinfüggő
kinázoknak a felfedezéséért, valamint működési mechanizmusuk tisztázásáért
részesültek a legnagyobb tudományos elismerésben. A kinázok mennyisége a sejtciklus
során állandó, aktivitásuk azonban a ciklinek által szabályozott módon változik.
A Nobel-díj Bizottság által is alkalmazott népszerű hasonlat szerint a ciklinek
és a tőlük függő kinázok együtt hajtják a sejtciklust fázisról fázisra. A
ciklin-dependens kinázmolekulákat tekinthetjük a hajtóműnek, a ciklineket
pedig a sebességváltónak, mely meghatározza, hogy a motor alapjáraton működjék-e,
vagy inkább előre hajtsa a sejtet a ciklusban.
 |
 |
 |
| |
|
|
Az egy- vagy többsejtű élő szervezetek
növekedése, fejlődése és szaporodása egyaránt a sejtek sokasodásán: növekedésén
és osztódásán alapul. A magasabb rendű többsejtű szervezetekre jellemző az
is, hogy sejtjeik folyamatosan cserélődnek; pusztulnak, és a tartaléksejtek
osztódásából származó újakkal pótlódnak. A növényekben és a gerinces állatokban
a tartaléksejtek sajátos struktúrákat alkotva csoportosulnak, úgynevezett
osztódó (merisztematikus, kambiális, germinatív) szöveteket alkotnak, amelyek
feladata egy-egy specifikus szövet növekedésének biztosítása, vagy pusztuló
sejtjeinek pótlása. A tartaléksejtek osztódásának és növekedésének szabályozása
kulcsfontosságú tényezője a szövetek, szervek normális növekedésének és differenciálódásának.
Ebből a szempontból kényes, soktényezős egyensúly uralkodik a normális növekedésű
szövetben. Egy jó- vagy rosszindulatú daganat kifejlődéséhez elegendő, ha
egyetlen testi sejtben történnek a sejtosztódást és -növekedést szabályozó
specifikus génekben mutációk. Érthető tehát, hogy a molekuláris sejtbiológiai
és a biomedicinális kutatások igen jelentős része miért foglalkozik a sejtosztódás
és
-növekedés megismerésével.
A valódi sejtmagvas sejtek (eukarióták) osztódása sejtmagosztódásból, mitózisból (M) és az azt követő kettéosztódásból áll. A gyakorlatban azonban a teljes sejtosztódást is szokás mitózisnak nevezni. Az osztódó sejtpopulációban a sejtek életciklusa születési folyamatukkal, vagyis az úgynevezett anyasejt mitózisával kezdődik. Ennek a mitotikus (M) fázisnak a terméke a két leánysejt, amelyek osztódászkkor örökítő anyagukat szintén (kromoszómáik DNS és fehérjemolekuláit) megkettőzik. A két M-fázis között tehát időnek kell eltelnie: ez az interfázis. Osztódó sejtpopulációkban tehát a sejtek életciklusai, vagyis az M- és az interfázisok, tehát az ún. sejtciklusok követik egymást. Testi sejteknél a DNS-szintézis fázisa, az S-fázis nem kezdődhet meg közvetlenül az M-fázis után, mert a sejtnek előbb növekednie kell. A mitózis végétől a DNS-szintézisig szükséges időszakaszt G1-fázisnak nevezik. A mitózisból kilépett "új" sejt csak akkor lép be a G1-szakaszba, ha ezt a sejten kívüli szabályozó molekulák által közvetített jel (mitogén szignál), állati és emberi sejteknél az illető sejttípusra nézve specifikus növekedési faktor jelenléte kiváltja. Növekedési faktor hiányában a sejt nyugalmi, ún. G0-fázisba kerül: kilép a ciklusból.
A növekedési faktorok a plazmamembrán
(a sejtet határoló lipoprotein hártya) specifikus fehérjemolekuláin, a receptoraikon
kötődnek meg. A receptorok viszik át a mitogén jelet a sejt belsejébe, ahol
azután a jelközvetítő molekulák a sejtmagba továbbítják azt. A mitogén jel
a sejtmagban a G1-fázisra jellemző géneket aktivál: megkezdődik a sejtciklus
molekuláris folyamatait az S-fázis felé előreléptető és egyben a citoplazma
növekedését serkentő fehérjék hírvívő-RNS molekuláinak, majd e fehérjék szintézise.
Az ily módon kifejeződő fehérjék között rendszerint jelen van valamely újabb
növekedési faktor receptora is, mely rövidesen megjelenik a sejtfelszínen,
és ha a sejt környezetéből hozzájut specifikus növekedési faktoraihoz, akkor
az előbbiekhez hasonló módon továbblépteti a sejtet a G1-fázisba. A sejt végül
is egy ponton elkötelezetté válik a DNS-szintézis megkezdésére: visszavonhatatlanul
elkezdődik az S-fázist végrehajtó molekulák (pl. a DNS-polimeráz) szintézise.
Ezt az elkötelezettségi pontot restrikciós pontnak (R-pont) nevezzük, tekintve,
hogy ezt megelőzően a növekedési faktor(ok) megvonása a G1-fázis leállását
és a sejt G0-fázisba húzódását eredményezi. E folyamat után a növekedési faktor
restrikció már hatástalan: a sejt a restrikciós pont átlépése után egy idő
múlva mindenképpen S-fázisba lép.
Az S-fázis vége és az M-fázis kezdete között is beiktatódik egy előkészítő
szakasz, a G2-fázis, melyre leginkább a sejtosztódást végrehajtó apparátus
szintézise a jellemző. Ily módon tehát a teljes sejtciklus az M-->G1-->S-->G2-fázisok
egymásutánjából épül fel (1. ábra). A G rövidítés az S- és M-fázis
közötti megszakítások angolnyelvű kifejezéséből (’gap’) ered.
1. ábra. A sejtciklus sémája. A mitotikus osztódásból (M-fázis) kilépő utódsejt csak akkor maradhat a ciklusban, ha környezetéből osztódást serkentő anyag (mitogén) hat rá. Ellenkező esetben kilép a ciklusból és G0-fázisba kerül. Mitogén hatásra belép az első előkészítési vagy növekedési szakaszba (G1-fázis), melynek során sorozatos génkifejeződések (RNS- és fehérjeszintézisek) segítségével éri el megfelelő méretét és felkészültségét a DNS-szintézis (S-fázis) megkezdésére. A restrikciós (R) vagy START pont előtt (korai G1) a sejt a mitogén megvonására G0-fázisba lépéssel reagál: kilép a ciklusból. Az R pont átlépése után (késői G1) már mitogénfüggetlen a ciklus: a sejt elkötelezetté vált az S-fázis beindítására. Ha a DNS-szintézis maradéktalanul és hibátlanul befejeződött, akkor a sejt továbbléphet a G2-fázisba, a mitózis előkészítő szakaszába. Ahhoz, hogy a sejt M-fázisba lépjen, az szükséges, hogy a mitotikus apparátus anyagai maradéktalanul rendelkezésre álljanak
Az elmondottakból nyilvánvaló, hogy a sejtciklus szabályozása külső mitogén tényezők függvénye, amelyek azonban egy sejten belüli, megszabott sorrendű lépésekből álló programot működtetnek a ciklizáló sejtekben. A növekedési faktorok sitmulálják a sejt felkészülését az S-fázisra. A restrikciós pont után a folyamatok már automatikusan követik egymást, és csak akkor állnak le, ha a folyamatokba hiba csúszik, vagy a sejtet külső eredetű sérülés (DNS-szintézis gátlás stb.) éri. A ciklus hibátlanságának, feltételei hiánytalanságának vizsgálata az ún. ellenőrzési pontokon (’check points’) történik. Maga az R-pont is közéjük tartozik: nem más, mint a G1-fázis végrehajtásának, tehát az S-fázis feltételeinek ellenőrzése és megkezdésének engedélyezése. Ellenőrzési pont felügyeli a DNS-szintézis (replikáció) hűségét, hibáit, és azt, hogy megtörtént-e a hibák javítása, valamint később azt is, hogy szabályosan épült-e fel a mitózis apparátusa, indulhat-e a magosztódás.
A sejtciklus folyamatainak sorbakapcsoltságát
szabályozó gének, és termékeik megismerése a folyamat lényegének felismerése
óta a kutatások egyik fő célja volt. Ebben a munkában a kutatások fő irányát
meghatározó felfedezést Yoshio Masui (Univesity pf Toronto, Canada) tette
meg 1971-ben, amikor elsőként igazolta, hogy a béka (Rana pipiens) petesejtjének
érésében, amely a számfelező osztódás (meiózis) egy szakaszán belül történik,
részt vesz egy fehérjeszintézis-függő promóciós faktor (MPF: ’maturation promoting
factor’), melyről kiderítették, hogy minden bizonnyal két komponense van,
és ezek egyike nagy valószínűséggel protein kináz aktivitással jellemezhető.
A protein kinázokról tudnivaló, hogy nem mások, mint foszforilázok, amelyek
a fehérjék megfelelő helyen lévő aminosav-építőköveinek hidroxil csoportjai
és a foszforsav között hoznak létre észtercsoportokat. Az így létrejött foszfoproteinek
aktivitása megváltozik: egyes defoszfoproteinek aktiválódhatnak, mások viszont
inaktiválódhatnak a protein kinázok hatására. A foszfoproteinek specifikus
protein foszfatázok működése révén veszíthetik el foszfát-csoportjaikat. A
sejten belüli fehérjék foszforilációja és defoszforilációja a fehérjeműködés
és ezáltal a sejtműködések ún. epigenetikai szabályozásának egyik legfontosabb,
leggyakoribb módja.
A fehérjeszintézis-függő promóciós faktor (MPF) mitózisbeli szerepét
kezdettől fogva gyanították, de csak 1978 és 1983 között sikerült ezt kétséget
kizáróan bizonyítani, mint ahogyan azt is, hogy aktivitásához két komponensre
van szükség. A 2001. évi orvosi Nobel-díjat az MPF két komponensének és génjeiknek
azonosításáért, hatásmódjuk tisztázásáért ítélték oda három egyenlő arányban
megosztva egy amerikai és két brit kutatónak. A két fehérjealegységből álló
fehérjeszintézis-függő promóciós faktor katalitikus (enzimatikus) komponense
egy specifikus protein kináz molekula, mely csak akkor nyeri el aktivitását,
amikor aktivátorával, a ciklin nevű regulátormolekulával heterodimert alkothat.
Ennek alapján ciklin-dependens kináznak (CDK) nevezik.
Leland Hartwel (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, USA, 1939) a díjat a sejtciklust ellenőrző gének felfedezésért kapta. Idevágó első közleményeit már 1970-71-ben megjelenttette. Kísérleti objektuma az egysejtű sörélesztő (Saccharomyces cerevisiae) volt, melyből több mint száz sejtosztódási ciklus (cell division cycle, CDC) mutánst izolált és vizsgált. A bizottság indoklása külön kiemelte a "start" gén (CDC28), kimutatását, melynek hiányakor (negatív mutációjánál) a sejtek nem képesek átlépni az élesztőkben a startnak, gerincesekben pedig a restrikciós pontnak nevezett ellenőrzési pontot. A start gén terméke végül is az élesztők ciklin dependens kinázának bizonyult. Ezen túl, Hartwel tanulmányozta az élesztősejtek ciklusának sugárérzékenységét is. Eredményei alapján világossá vált, hogy a sejtciklus leáll, ha a DNS-molekulák sérülnek. Ennek célja az, hogy időt biztosítson a hibajavításra, a reparációra. Ezt nevezte el az S-fázis ellenőrzési pontjának. Később ezt a fogalmat kitejesztette további molekuláris történésekre, melyek a sejtciklus fázisainak sorrendjét hivatottak biztosítani. Hartwel vezette be tehát az ’ellenőrzési pont’ fogalmát, ami értékes hozzájárulás volt a sejtciklus megértéséhez.
Paul Nurse (Imperial Cancer Research Fund, London, UK, 1939) Hartwelhez hasonlóan a genetikai megközelítést követte. Modellsejtje az egysejtű hasadó élesztő (Schizosaccharomyces pombe) volt. Ez az egysejtű gomba csak távoli rokona a sörélesztőnek, hiszen evolúciójuk valószínűleg több mint 1 milliárd évvel ezelőtt vált el egymástól. Nurse fedezte fel ebben az élesztőben azt a sejtosztódási ciklus mutáns gént (cdc2-t), melyről az 1970-es évek közepén bizonyította be, hogy ez a gén ellenőrzi a G2-mitózis átmenetet. Majd kiderítette, hogy e géneknek és termékeiknek ennél általánosabb a szerepe: S.pombe-ban megfelel a S.cerevisiae start génjének, tehát az S-fázisba lépést is kontrollálja. 1987-ben izolálta ugyancsak ennek a génnek humán analógját. Ez a gén és analógjai, valamint termékeik kapták később a CDK1 megnevezést. Nurse kimutatta, hogy a CDK1 aktiválhatósága maga is reverzibilis foszforilációktól, tehát más, specifikus kinázok és foszfatázok aktivitásától függ. Ezen eredmények alapján humán sejtekben több mint fél tucat különböző CDK-molekulát találtak.
R. Timothy (Tim) Hunt (Imperial Cancer Research Fund, London, UK, 1943) az 1980-as évek elején fedezte fel az első ciklinmolekulát. A ciklinek családjába tartozó fehérjék túlnyomó többsége a sejtciklus egy meghatározott fázisában szintetizálódó, a hozzá tartozó (specifikus) CDK-hoz kötődve azt aktiváló, majd a ciklus egy következő meghatározott fázisában lebontódó (degradálódó) fehérje. Hunt egy tengeri sün (Arbacia) korai embrionális osztódásainak tanulmányozása során talált rá az első ciklinre, amelynek periodikus degradációját és újraszintetizálódását is leírta. A periodikus proteindegradáció utóbb fontos sejtciklusszabályozó kontroll-mechanizmusnak bizonyult. Tim Hunt később más fajokban is rátalált a ciklinekre, és kimutatta, hogy evolúciós szempontból konzervált szerkezetűek: a gének bázissorrendje és következésképpen fehérje-termékeik aminosavsorrendje is csak kevéssé különbözik ha egymástól milliárd évnyi evolúciós távolságban lévő fajokat hasonlítunk is össze. A konzervált gének és termékeik funkciói nélkülözhetetlenek a fajok és ezzel az élet fenntartása szempontjából. Ezidáig mintegy tíz különböző ciklint azonosítottak humán sejtekben.
Az első ciklin és CDK felfedezése óta megismertük a ciklus fázisainak sorbarendezési módját is (2. ábra). Emlős és humán sejtekben négy különböző ciklin-CDK komplex működik sorbakapcsolva. Mint említettük: az osztódással frissen keletkezett "új" sejt csakis a neki megfelelő sejtenkívüli növekedési faktor hatására léphet be a ciklusba, vagyis a G1-fázisba. A növekedési faktor által közvetített jelre a sejt új gének kifejezésével, azaz új minőségű fehérjemolekulák szintézisével reagál. Az újonnan kifejeződő fehérjék között jelennek meg a sejtben a restrikciós ponton ellenőrző ciklin D molekulák. Ezek CDK partnereikkel, a G1-fázis előrehaladtával, fokozatos foszforiláció útján szabályozzák a ciklus továbblépéséhez szükséges szabályozómolekulák, végső fokon pedig specifikus transzkripciós faktorok aktivitását. A restrikciós ponton engedélyt kapott, aktiválódott átírási faktorok beindítják az S-fázisba lépéshez szükséges gének kifejeződését. Az új fehérjék között megjelenik az S-fázist ellenőrző ciklin E, miközben a ciklin D molekulák lebomlanak. Az S-fázis végén ezzel teljesen azonos módon indítja be a Ciklin E-CDK komplex a G2-fázisban működő Ciklin A kifejeződését, és végül a ciklin A és CDK partnere Ciklin B szintézisét. Ezutóbbi felelős CDK partnerével együtt a mitózist beindító és fenntartó MPF aktivitásért.
2. ábra. A ciklinek ciklusa. A mitózisból küépett sejt a mitogén hatására megkezdi, többek között, a G1-ciklinek (ciklin D-változatok) szintézisét. Szintézisük fenntartásához az R pontig mitogén hatás szükséges. Az újonnan megjelenő ciklin D molekulák kötődnek hosszú (több ciklusra is kiterjedő) életidejű és állandó koncentrációjú ciklin-dependens kináz (CDK4 vagy CDKS) partnerükhöz és ezáltal aktiválják őket. A szóban forgó CDK molekulák legfontosabb célpontja az ún. retinoblasztóma gén fehérjeterméke (P105). Ez megkötve, inaktív állapotban tart olyan speciális transzkripciós faktorokat (az E2F1 család tagjait), melyek, többek között az S-fázis megindításához szükséges fehérjék génjeit aktiválják. A P105 fehérjén számos foszforilálható hely van, melyek a ciklus elején még üresek, majd a G1-szakasz előrehaladtával az állandóan sokasodó ciklin D-CDK komplexek folyamatosan foszforilálják őket. A P105 molekulák az R pontnál kerülnek maximálisan foszforilált állapotba. Ennek hatására elengedik az eddig fogva tartott traszkripciós faktorokat, amelyek aktiválják a késői G1-fázisban szintetizálódó és az S-fázisban működő fehérjék génjeit. Ezek közé tartozik a ciklus következő továbblépését biztosító ciklin E is. A restrikciós pont után megjelennek a CDK enzimgátlói, a ciklin D-CDK dimerek disszociálnak, és a ciklin lebomlik. Megindult azonban már a ciklin E szintézise. Partnere a CDK2: Dimerjük az előzőekkel teljesen azonos módon szabályozza egy retinoblasztóma családba tartozó újabb fehérje, a P107 működését, amely az S-fázis vége előtt az E2F2 géncsaládba tartozó transzkripciós faktorokat köt. Utóbbiak hatására jelennek meg, többek között, a G2-fázisban működő ciklin A molekulák, miközben a ciklin E lebomlik. A ciklin A ugyancsak a CDK2-vel alkot heterodimert, és a P13 retinoblasztóma típusú fehérjén, valamint az E2F3 család átírási faktorain keresztül indítja be a legelsőként felfedezett ciklin, a ciklin B szintézisét, majd degradátódik. Az M-fázist ellenőrző ciklin B partnere a CDK1. A komplexük feladata az M-fázis fenntartása: nem indukálják üjabb ciklin megjelenését. A CDK1 aktivitását specifikus foszforilációk és defoszforilációk, míg a többi CDK-ét gátlófehérjék szabályozzák. A ciklin B az M-fázis végén bomlik le. A ciklus genetikai történései: 1 - sejtnövekedés; 2 - kromoszómakettőződés; 3 - magosztódás: a kromoszómák elosztása a "leánysejtmagok" között; 4 - sejtosztódás
Az ismertetett sorbakapcsolt ciklinfüggő folyamatok tehát képesek arra, ha egyszer a G1-fázisú sejt átlépte a restrikciós pontot, akkor a folyamatok már a külső szabályozástól függetlenül, automatikusan, az egyes ciklinek kifejeződésének és a specifikus foszforilációknak az időszükségletétől függően meghatározzák a sejtciklus történéseinek sorrendjét és időbeli szakaszolását.
A ciklus előreléptetése azonban nem mindig zavartalan. Az automatizmus gátló hatásokon keresztül szabályozódik. Ha például az S-fázis ellenőrző pontjának központi tényezője, a P53 elnevezésű fehérje valamilyen mutáció jeleként szakadást, szabad végeket érzékel a DNS-molekulán, akkor jelet ad a replikáció leállítására. Hatására CDK-inhibítorok génjei aktiválódnak, és megjelennek például olyan gátló molekulák, melyek a CDK2 molekulákhoz kötődve szabályozzák azok kinázaktivitását. Az ílymódon relatíve túlnyomóvá vált protein foszfatázok csökkentik a kináz által serkentett fehérjemolekulák aktivitását. Ezért a ciklin-CDK-függő folyamatok is szabályozódnak. Konkrét példánkban az S-fázis a DNS-reparáció idejére leáll.
A 2001. évi orvosi Nobel-díj kitüntetettjeinek munkássága valóban alapvető volt a sejtciklus molekuláris szintű szabályozásának megismerésében. Ennek természetesen nagy elméleti jelentősége van, hiszen közelebb visz bennünket a természetben nagyon gyakori körfolyamatok egyikének megértéséhez. A kutatásokat, a sikerességükhöz szükséges társadalmi beruházások szükségessége miatt azonban az ismeretek gyakorlati haszna hajtja a céljuk felé. A sejtciklussal kapcsolatos alapkutatási felfedezésekből a biomedikális kutatások majd’ minden ága hasznot fog húzni. Ismeretessé vált, hogy például a ciklin-D1 génjének (bcl1) létezik olyan mutációja, mely a molekulát konstitutívvá (szabályozatlanná) teszi, és ílymódon az egy rosszindulatú megbetegedés, a B-sejtes limfóma egyik közvetlen génikus okává, vagyis onkogénné vált. Továbbá a daganatsejtek igen gyakori és jellemző tulajdonsága például, hogy bennük a P53-gén inaktív, a P53-fehérje nem, vagy inaktív mutánsával fejeződik csak ki. Ezzel kiesik például a DNS szabad végeinek, töréseinek érzékelése és a ciklin-függő kinázok aktivitásának következményes szabályozása. A rosszindulatú daganatsejtekben a DNS-mutációk, kromoszóma-rendellenességek halmozódnak, mint azt mondani szokták: e sejtek genetikai instabilitása inherens. Eközben a CDK aktivitások relatív, vagy abszolút túlsúlya alakul ki, ami pedig szabályozatlanul túlpörgeti a sejtciklust. Különösképpen jellemző ez például emlőrákokra és agydaganatokra. A fehérjebiokémia és a molekulaszerkezet-modellezés fejlettsége ma már azt is lehetővé teszi, hogy enzimek, köztük a ciklin-dependens kinázok gátlómolekuláit, mint reménybeli gyógyszereket az enzimműködés szerkezeti alapjainak ismeretében megtervezzék és szintetizálják. Jelenleg a CDK-inhibítorok fejlesztése már a klinikai kipróbálás fázisában van, ami remélhetőleg szélesebb körű alkalmazásukhoz vezet majd a daganatellenes kemoterápiában.