SZABAD JÁNOS

A testszerveződés szabályozása


1995-ben az orvosi Nobel-díj odaítélésével a Nobel-bizottság három olyan fejlődésgenetikus eredményeit ismerte el, akik úttörő munkát végeztek az egyedfejlődés genetikai szabályozásának megértéséért. Ed Lewis, Christiane Nüsslein-Volhard és Eric Wieschaus kimutatta, hogy a petesejtek citoplazmája több olyan tényezőt is tartalmaz, amelyek úgynevezett anyagi hatás útján irányítják az utódok embriogenezisét. Bebizonyították, hogy az embrióknak olyan génjeik vannak, amelyek értelmezik az anyai eredetű üzeneteket. Igazolták, hogy az embriósejtek fejlődési programja fokozatosan, részletekben történik. A Nobel-díjasok munkássága alapján megértettük az atavizmus és a meddőség genetikai alapjait, és megismertük a testszerveződést szabályozó gének jellegzetességeit. Kiderült, hogy a testszerveződés általános jelenség, hasonlóan zajlik az élőlényekben: a muslicában, a csirkében, az egérben és az emberben is. Ez az orvosi Nobel-díj egyben tisztelgés az élővilág egysége előtt.
 
 

Ed Lewis
Christiane Nüsslein-Volhard
Eric Wieschaus

A Cynthia partita zsákállat petéinek citoplazmáját öt különféle színű és átlátszóságú rész alkotja, amelyek az embriogenezis során más és más sejtek alkotóivá válnak. A sötétsárga rész például a farok izomsejtjeinek kialakulásával, a világossárga a mezoderma, a világosszürke az idegrendszer, az átlátszatlan szürke az endoderma, az átlátszó rész pedig az ektoderma képződését kódolja. Ha egy Cynthia-petéből vékony tűvel kiszívjuk a sötétsárga részt, az embriónak nem képződik farokizomzata. Így tűnik tehát, hogy a Cynthia és sok más faj embriójának sorsa a petékben mozaikszerűen van elrendeződve. A citoplazma alkotói anyai eredetűek, a petefejlődés során képződnek.

A kutatások azt is kiderítették, ha egy éppen megtermékenyült béka petéjéből eltávolítják a sejtmagot, és vele együtt a zigóta génjeit is, a mag nélküli (enukleált) sejtek osztódása kezdetben ugyanolyan tempóban halad, mint sejtmagvas testvéreiké. Természetesen néhány osztódás után lelassul a sejtek osztódása és végül megáll, de addigra már néhány száz “sejt képződött. A reménytelen sorsú lény úgy néz ki, mint egy ebihal. A vizsgálat azt mutatja, hogy a békaembriók fejlődéséhez nincs szükség a zigóták saját génjeire, az embriogenezist a peték citoplazmájában jelen levő tényezők irányítják. Azt a jelenséget, hogy az embriók kezdeti fejlődését a petesejtekben levő tényezők irányítják, szokás anyai hatásnak nevezni. Azt is tudjuk, hogy a muslica embriogenezise során több, mint tíz osztódás történik anélkül, hogy a zigóta génjeire szükség lenne. Mire az embriók saját génjei aktivizálódnak, a sejtek fejlődési programja már nagy vonalakban meghatározott.

Bebizonyosodott az is, hogy az anyai hatás nemcsak az alacsonyabb rendűekre, hanem az egész állatvilágra kiterjedő általános jelenség.

A genetikai boncolás

Az anyai hatás tényezőinek megismerésére Ch. Nüsslein-Volhard és E. Wieschaus az ún. genetikai boncolás módszerét választotta. A módszer lényege a következő: ha léteznek olyan gének, amelyek az anyai hatás mediátorait kódolják, úgy azok a gének mutációkkal elronthatók, a mutáns fenotípusok alapján pedig következtetni lehet az ép gén funkciójára. Ha például egy nőstény homozigóta egy olyan mutációra, amely az anyai hatás valamely tényezőjét kódolja, tőle látszólag csupa ép peték származnak. A peték megtermékenyülnek, elkezdődik bennük az embriogenezis, de rövid időn belül elakad az anyai eredetű tényező hiányában és az embriók elpusztulnak. Végeredményben a mutáns nőstények sterilek, nem lesznek utódaik. Az anyai hatás mediátorait kódoló géneket tehát a nőstények sterilitását okozó ún. nőstény-steril (fs) mutációkkal lehet azonosítani. Az ép géneket a mutáns fenotípus alapján szokás elnevezni.

Ch. Nüsslein-Volhard, E. Wieschaus és G. Jürgens Heidelbergben, az Európai Molekuláris Biológiai Laboratóriumban 1978-tól kezdődően előbb mutációkat okozó (mutagén) hatásokkal véletlenszerűen "rontottak el" muslicagéneket, indukáltak mutációkat. Majd olyan nőstényeket állítottak elő, amelyek homozigóták voltak a mutációk valamelyikére. A véletlenszerűen indukált mutációk közül kiválogatták azokat a steril nőstényeket, amelyek petéiben elpusztultak az embriók. Az elpusztult embriók vizsgálata során derült ki, hogy anyai eredetű tényezők szükségesek a muslicaembriók hasoldalának képződéséhez.

Arra a kérdésre, hogy a Nobel-díjasok miért éppen a muslicát választották, egszerű a válasz. A Drosophila melanogaster ideális modellfaj a genetikai, sejt-, fejlődés- és molekuláris biológiai kutatásokhoz, mert nagyon szapora, egy szülőpártól százszámra származhatnak utódok. A generációs ideje mindössze 10-12 nap. Olcsón, egyszerűen fenntarthatók. További ok, hogy genomjukat mindösze négy kromoszóma alkotja, amelyek alig több, mint ötezer gént tartalmaznak. Kromoszómáik, különösen a nyálmirigy óriáskromoszómái, kényelmesen vizsgálhatók. A több tucatnyi markermutáció pántlikaszerűen jelöli a kromoszómákat. Minthogy a muslica genomja viszonylag kicsi, kiválóan alkalmas a molekuláris genetikai munkákra. Jól ismert a muslica fejlődés- és sejtbiológiája. A muslicával kapcsolatos kényelmi szempontoknál sokkal fontosabb tudni azt, hogy az öröklődés törvényszerűségei az emberre is érvényesek lesznek.

A hasi-háti polarizáció és a dorzális géncsoport

A nőstény steril (fs) mutáns fenopítusok vizsgálata alapján derült fény arra, hogy a muslicagenomban tizenegy olyan gén van, amelyek az ún. dorzális géncsoportot alkotják (1. táblázat). Bármelyikük funkcióvesztéssel járó recesszív mutációja ún. csupahát embriók képződéséhez vezet (1. ábra). A csupahát embriókban a hasoldali sejtek is a hátoldali fejlődési programot követik: epidermisz sejtjeik a hátoldalra jellemző, csőszerűen elrendezett kutikulát választanak ki. A csupahát embriók természetesen elpusztulnak. Létezésük azt bizonyítja, hogy a hasoldal képződéséhez anyai eredetű tényezőkre van szükség. Citoplazma-injekciókkal lehetett bizonyítani, hogy valóban hiányzik valami a mutáns nőstények petéiből. Amikor ugyanis ép peték citoplazmáját injektálják a mutáns nőstények petéibe, gyakran képződtek ép embriók.

1. ábra. A. A blasztoderma "sorstérkép" azt jelzi, hogy a kb. hatezer sejt közül melyikből milyen sejtek fognak differenciálódni. (Eric Wieschaus rajza.) B. A dorsal/dorsal anyáktól jellegzetes csupahát embriók származnak, amelyek a peték burkán belül pusztulnak el. C. A dorsal fehérje a hasoldali sejtekben mutatható ki. Koncentrációja gradiens mentén csökken a hátoldal felé. E. A dorsal fehérje a sejtmagban lokalizált, ott géneket kapcsol be és ki

A kettős mutánsokon végzett kísérletek azt is bebizonyítják, hogy a dorzális géncsoport tagjai közül a dorsal  gén a kulcsfontosságú. A Toll génben indukált domináns mutációk csupahas embriók képződését eredményezték, nőstények minden embriójának csak hasoldala képződött. Mivel azonban a dorsal: Toll a kettős mutáns nőstények minden embriója csupahát lett, arra lehetett következtetni, hogy a dorsal fehérje hiányában a mutáns (Toll) fehérje hatástalan, tehát a dorzális géncsoport hierarchiájában a dorsal gén alapvetőbb fontosságú, mint a Toll.

1. táblázat. A hasi-háti irányú differenciációt szabályozó dorzális géncsoport

A dorsal fehérje gradiensszerűen oszlik el a blasztoderma sejtekben: koncentrációja a hasoldaltól a hátoldal felé haladva fokozatosan csökken, a hátoldali sejtekben pedig nincs dorsal fehérje. Érthető tehát, hogy a dorsal/dorsal mutás nőstényektől (mert petéikben nincs dorsal fehérje) csupahát embriók származnak. A dorsal fehérje a morfogének egyike: közvetlenül meghatározza a sejtek fejlődési programját, s nem más, mint egy transzkripciós faktor, amely az embrió DNS-ének megfelelő helyeihez kapcsolódva géneket aktivál vagy inaktivál.

A muslicaembrióknak lehetnek olyan génjei, amelyek kifejeződését a dorsal fehérje szabályozza, és szintén elronthatók mutációkkal. Várható, hogy a mutációra a homozigóta embriók úgy fognak kinézni, mint a dorsal/dorsal anyáktól származók csupahát embriók lesznek és elpusztulnak.

2. ábra. A dorsal fehérje az utódok twist génjét a hasoldalon bekapcsolja (A), és megakadályozza a zen gén kifejeződését a hasi és az oldalsó sejtekben. (B) A dorsal/dorsal nőstények utódaiban a twist gén nem kapcsol be, a zen gén viszont minden sejtben kifejeződik. A dorsal fehérje a twist gén pozitív, a zen gén negatív regulátora

A dorsal/dorsal nőstények petéiben azonban van egy olyan (zen) gén, ami normális körülmények között az embriók hátoldali sejtjeiben fejeződik ki (2. ábra), jelezve, hogy a dorsal fehérje akadályozza ennek a génnek a kifejeződését a hasoldalon. Tehát a dorsal fehérje, a morfogén egyike, az embrió génjeinek ki- és bekapcsolásával szabályozza a sejtek differenciációját a has-hát irányában. A dorsal fehérje koncentrációjától függően a (twist, a zen és más) gének különböző mértékben fejeződnek ki. A twist és a zen fehérjék további géneket be- és kikapcsolva határozzák meg a sejtek fejlődési programját, azt, hogy belőlük pl. mezoderma, idegrendszer vagy epidermisz differenciálódjon.

Az elülső-hátulsó polarizáció

Azt, hogy a muslicapetékben az embriótest elülső-hátulsó irányú differenciációját szabályozó anyagok vannak, szépen mutatják a következő kísérletek. Ha vékony tűvel megszúrjuk egy muslicapete elejét, onnan kifolyik egy csepp citoplazma. A "meglékelt" petében olyan embrió képződik, amelynek hiányzik a feje és gyakorta a tor elülső része is. Ha a hátulsó végén "lékelik" meg a petéket, az embrióknak a potroha hiányzik. Ha egy pete elülső részébe, a peték rövid szikkasztása után, egy másik pete hátsó végéből származó citoplazmát injektálnak, semmi lényeges nem történik. Abban az esetben azonban, ha előbb meglékeljük egy pete elejét, majd oda egy másik pete hátulsó végéből injektálunk citoplazmát, a petében "kétfenekű" embriók fejlődnek. Kétfejű embriók képződnek azokban a petékben, amelyek hátulsó végéből eltávolítunk egy kevés citoplazmát, majd a helyébe egy másik pete elülső részéből injektálunk citoplazmát.

A lékeléses és a citoplazma-átültetéses kísérletek eredményei azt bizonyítják, hogy (1) a peték elülső és hátulsó végében az embriótest elülső és hátulsó végét szervező tényezők vannak, (2) a két tényező ellentétes hatású. A fenti kísérletek az első-hátulsó irányú differenciációt szabályozó tényezők természetéről semmit sem mondanak.

2. táblázat. Az elülső-hátulsó irányú differenciációt szabályozó gének

A genetikai boncolás során azonosított gének azonban annál többet. Az fs mutáns (steril) nőstények között Nüsslein-Volhard és Wieschaus olyanokat is felfedezett, amelyekben az embrióknak vagy (1) a feji, vagy a (2) hátulsó vagy (3) a terminális részei hiányoztak (2. táblázat). Az fs mutációk tehát három géncsoportot is azonosítottak: az elülső, a hátulsó és a terminális géncsoportokat. Az elülső csoport esetében az embriók nagyon hasonlítottak azokhoz, amelyek az elejükön meglékelt petékben fejlődtek, jelezve, hogy elülső géncsoport tagjainak valamelyike az embriótest elülső részét szabályozó tényezőt kódolhatja. Megdöbbentő a hasonlóság a hátulsó csoportba tartozó embriók és azok között, amelyek a hátulsó végükön meglékelt petékben fejlődtek.

Az elülső géncsoportot alkotó gének közül, itt nem részletezett adatok alapján, a bicoid gén szerepe kulcsfontosságú. A bicoid mRNS molekulák a peték elülső részében vannak, a sejtvázhoz kötve. A bicoid mRNS-ekről röviddel a blasztoderma stádium előtt képződnek a bicoid fehérje molekulák, amelyek koncentrációja egy gradiens mentén csökken elülről hátrafelé. A bicoid fehérje is egy morfogén: közvetlenül meghatározza az embriósejtek fejlődési programját. Valójában a bicoid fehérje is egy transzkripciós faktor: olyan molekula, amely a DNS megfelelő helyeire kapcsolódva géneket kapcsol be vagy ki az embriósejtekben.

Nüsslein-Volhard és Wieschaus mutatta meg, hogy a muslica hunchback génjének mutációja olyan fejnélküliséget eredményez, mint amilyet a bicoid mutáció, jelezve, hogy a hunchback (hb) génnek lehet szerepe bicoid fehérjében rejlő anyai üzenet értelmezésében. Amíg a hunchback gén a vad típusú nőstények embrióiban az elülső sejtekben fejeződik ki, addig a mutáns bicoid nőstények petéiben a hunchback gén nem kapcsol be, vagyis a bicoid fehérje bekapcsolja a hunchback gént. A hb gén éppen azokban a blasztoderma sejtekben fejeződik ki, amelyekből majdan a fej és az elülső torszelvények képződnek, az embrió egy jól meghatározott részében. Érthető, ha a hunchback mutáció eredményeként az embriók testének egy jól meghatározott része hiányzik. A hunchback mutáció az ún. résmutációk jellegzetes képviselője.

A Krüppel (Kr) mutáció, amely szintén rés mutáció, az embriósejtek egy másik csoportjának fejlődését szabályozza. A Kr gén azokban a sejtekben fejeződik ki, amelyekből a hátulsó tor és az elülső potrohszelvények képződnek. A bicoid mutáns nőstények petéiben a Kr gén a legelülső sejtekben is kifejeződik jelezve, hogy a bicoid fehérje akadályozza a Kr gén kifejeződését az elülső sejtekben.

A hátulsó és a terminális gének az elülsők mintájára szabályozzák a potroh, valamint a nem szelvényezett részek kialakulását.

Lényegében tehát az anyai eredetű tényezők koncentrációjuktól függően az embrió génjei közül az ún. rés géneket kapcsolják be vagy ki. A rés gének termékei is DNS-hez kapcsolódó fehérjék, amelyek legfontosabb szerepe azoknak az ún. páros (pair-rule) géneknek a ki- vagy bekapcsolása, amelyek szelvénypárok kialakulását szabályozzák. A páros gének termékei azoknak az ún. szelvény polaritás géneknek a kifejeződését szabályozzák, amelyek a szelvénypárokon belül az elülső-hátulsó irányú differenciálódásért felelősek. A következő lépésben aktiválódnak az ún. homeotikus gének, amelyek a szelvények azonosságát határozzák meg.

Homeózis és atavizmus

A homeózis, a homeotikus gének természetének és funkciójának megértése terén végzett alapvető munkásságával érdemelte ki Ed Lewis a Nobel-díjat. Mestere, Alfred H. Sturtevant hívta fel a figyelmét a négyszárnyú muslicákra. A muslicának, a kétszárnyú rovarok egyikének, a harmadik torszelvényén rezgők (billérek vagy halterák) képződnek, a négyszárnyú muslicáknak harmadik torszelvénye a másodikhoz hasonlóan fejlődik. (A hasonló görögül homeot jelent, innen a homeotikus mutáció elnevezés.) A négyszárnyúságot egyetlen gén mutációja okozza. A mutációval azonosított gén fontos: meghatározza a harmadik torszelvénysejtek azonosságát, mesterként szabályozza az ún. realizátor géneket, amelyek realizálják a harmadik torszelvényre jellemző fejlődési programot (3. ábra).


3. ábra. A vad típusú (A) és a híres négyszárnyú muslica (B). A vad típusú harmadik torszelvényből dobverőszerű rezgő (billér vagy haltera) nő ki. A négyszárnyú muslica harmadik torszelvénye helyén, egy mutáció miatt, második fejlődött, a jellegzetes szárnypárral

A négyszárnyú muslicák a törzsfejlődés egy korábbi állapotát mutatják. A mutáció, amely a négyszárnyúsághoz vezet, az atavisztikus mutációk egyike. A négyszárnyú muslicák vizsgálatával remény nyílt egy régóta ismert jelenség, az atavizmus természetének megértésére. Gondoljunk csak olyan emberi nyomorúságokra, mint a nyúlszáj (természetes állapot rágcsálóknál), vagy a kétszarvú méhre (mint a szarvasmarhák méhe), a többmellbimbójúságra (kutya, sertés, nyúl stb.) vagy a szívkamrák falának hiányára (gyíkok, kígyók, teknősök), a policisztás vesére (hüllők, madarak). Ha értjük az atavizmus természetét, meg lehet előzni e rendellenességeket. Ed Lewis 1946-1978 között mutációkkal azonosította az ún. bithorax (Bx) génkomplexet és annak elemeit, amelyek a muslicatest hátulsó részének képződését szabályozzák. Elsősorban Thom Kaufman (Bloomington, Indiana) derített fényt az ún. Antp (Antennapedia) komplexre, amelynek génjei a muslicatest elülső részében határozzák meg a szelvények azonosságát. Ma sem értjük, hogy miért, de az Antp és a Bx komplexekben a gének ugyanolyan sorrendben követik egymást, mint ahogy a valóságban a szelvények. A homeotikus géneket ma már molekulárisan is ismerjük. B. McGuiness és M. Levine valamint M. Scott hasonlította össze a muslica nyolc homeotikus génjének szekvenciáit. Kiderült, hogy a homeotikus géneknek van egy közös része, az ún. homeobox. A homeobox 180 bázispár hosszú, és a kódolt fehérjének egy olyan, 60 aminosavból álló ún. homeodomén részét kódolja, amellyel a fehérjék a DNS-hez kapcsolódnak. A homeogének alapján képződő fehérjék más géneket kapcsolnak be. (Gyurkovics Henrik, a Szegedi Biológiai Központ munkatársa a homeotikus gének szakértője, Ed Lewisszel munkakapcsolatban áll.)

A homeobox izolálása nyomán nyílt lehetőség annak kimutatására, hogy van-e például a gerincesekben is homeobox. Walter Gehring laboratóriumában mutatták ki azt, hogy a szelvényezettséget mutató élőlények mindegyikében van homeobox. Ha a homeobox alkotója pl. az egerek némelyik génjének, feltételezhető, hogy az illető gének a test szerveződését szabályozzák az egerekben. A homeobox segítségével az egerek génjei közül “kihalászták a homeobox tartalmú géneket. Megvizsgálták őket, és kiderült, hogy (1) szerveződésük nagyon hasonló ahhoz, amit a muslicában tapasztaltak és (2) jószerivel ugyanúgy szervezik a szelvények képződését egerekben, mint a muslicákban. A muslicákra jellemző nyolc génnel szemben az egerekben és az emberben is négyszer nyolc testszelvényképződést szabályozó gén van.

Időközben lehetőség nyílt arra is, hogy - itt nem részletezett módon - egerek ép génjeit olyanokra cseréljék ki, amelyeket tetszőleges helyen in vitro mutagenizáltak. A mutáns egerekben jellegzetes fejlődési rendellenességek alakultak ki. A mutánsok többnyire embrióként pusztultak el, például a gerincvelő elülső szakaszából is utóagy fejlődik, az episztrofeusz helyett is atlasz fejlődik, bordák képződnek a nyakcsigolyákon vagy az ágyéktájon, szív-, vese-, belsőfül-rendellenességek alakulnak ki, amelyet már az emberben is régóta ismerünk.

A négyszárnyú muslicákból kiindulva eljutottunk a fejlődési rendellenességekig. Világos, hogy a test szelvényezettségének genetikai alapjai azonosak az állatvilágban. A homeobox tartalmú gének alapján nemcsak sok fejlődési rendellenesség természetét értettük meg, hanem lehetőség nyílt a törzsfejlődéssel kapcsolatos kérdések megválaszolására is.
 
 

 

Az iskola

Az 1995. évi orvosi Nobel-díjnak komoly előzményei vannak. Ed Lewis annak a T. H. Morgannak a laboratóriumában tanulta a genetikát, aki 1933-ban kapott Nobel-díjat. (Morgan és munkatársai bizonyították először, hogy a gének a kromoszómákon gyöngyfüzérszerűen helyezkednek el.) Eric Wieschaust az a D. F. Poulson indította el pályáján, aki maga is Morgan-tanítvány volt. Wieschaus frissen doktorált fiatalemberként Zürichben annak a R. Nöthigernek volt a munkatársa, aki annak idején Ed Lewisszel dolgozott. Nöthiger és W. Gehring Ernst Hadorn-tanítványok. Hadorn a fejlődésbiológia óriásainak, F. Baltzernak és Theodor Boverinek a szellemi örököse. Nüsslein-Volhard és Wieschaus Bázelban, W. Gehring laboratóriumában kezdtek el közösen dolgozni. Azt remélem, hogy olvasóim egyetértenek velem: az iskola, az indíttatás alapvető fontosságú nemcsak a Nobel-díjasok, hanem valamennyiünk életében is. (Írásunk szerzője 1975/76-ban R. Nöthiger laboratóriumában együtt dolgozott E. Wieschausszal. Közös munkánkból három dolgozat született. 1985-ben Tübingenben Ch. Nüsslein-Volharddal folytattunk közös kutatásokat. A munka gyümölcse egy Nature-dolgozat volt.)
 


 


Orvosi Nobel-díjak