"Ha az ember magára tekint, először a testét látja, azaz bizonyos anyagmennyiséget, melyet sajátjának mondhat. De hogy megérthesse, hogy mi is ez, össze kell hasonlítania mindazzal, ami felette van és mindazzal, ami alatta van, hogy pontos határait megismerhesse. És ne csak a közvetlenül környező tárgyakat nézze, hanem a teljes természetet fenséges tökélyében, méltóságában. Nézze a vakító fényességet, mely mint valami örök lámpa világítja be a mindenséget, pályáján futó parányi pont legyen a Föld szemében, és döbbenjen rá, hogy ez a hatalmas pálya maga is csak finom kis vonás az égbolton haladó többi égitest pályájához képest. És ha nem láthatunk már többet, szálljon tovább a képzeletünk. Képzeletünk elfáradt, de a természet kimeríthetetlenül gazdag marad…"
 
 

John B. Fenn	Koichi Tanaka	Kurt Wüthrich

Mintha a mai világunk híján volna a megállásnak, az elmerengésnek és a reflexiónak. Pedig egy-egy ünnep, kitüntetés és elismerés, például a Nobel-díj kihirdetése, ezt a célt is szolgálhatná. 2002-ben a Nobel-díj-bizottság a kémia területén olyan kutatók munkáját ismerte el, akik a biológiai szempontból fontos fehérjék tömegspektrometriás azonosításához, illetve azok oldatfázisú szerkezetmeghatározásához járultak hozzá. Az előbbi módszer kifejlesztésében John B. Fenn (Egyesült Államok) és Koichi Tanaka (Japán), míg az utóbbi eljárás megalkotásában Kurt Wüthrich (Svájc) végzett úttörő munkát. Összehasonlítva ezeket más, korábban Nobel-díjjal honorált szakterületekkel, feltűnő, hogy még a természettudomány iránt érdeklődők körében is kevesen vannak, akik mindkét eljárást alaposan ismerik.

 Ezek a módszerek olyan eredményekkel kecsegtetnek, amelyek akár már a közeljövőben áttörést eredményezhetnek a szerkezeti kémia és biokémia, a molekuláris biológia, a virológia vagy akár a patológia ma ismert határain. Megsejthetővé válik e két terület kiemelkedő fontossága, ha arra gondolunk, hogy a korszerű tömegspektrometria (Mass Spectroscopy, röviden MS) ma akár néhány nanogramm (10^-9 g) minta összetevőit pontosan azonosítani tudja. Egyes esetekben az MS-eljárások és a meglevő adatbázisok együttes alkalmazásával - a molekulát felépítő alkotórészek összetétel-analízisén keresztül - következtethetünk az eredeti minta (pl. fehérje) biológiai feladatára. Napjainkban, amit egyes szakemberek "posztgenomikus" korként jellemeznek, kiemelten fontos feladat nagyszámú, de kis mennyiségű fehérje „rutinszerű” azonosítása. Sokan úgy vélik, hogy a "genomika" után, amikor elsősorban a gének föltérképezése a feladat, a "proteomika" kora érkezett el, amikor is a DNS-ben kódolt fehérjék szerkezeti és biokémiai megismerése a cél. 

 Ennek jegyében a kutatók olyan fehérjék megismerését tűzhetik ki célul, mint a daganatos elváltozásokban, a prionbetegségekben (pl. kergemarhakór) vagy az idegrendszer degeneratív kórképeiben (pl. Alzheimer-kór) fontos szerepet játszó, vagy a programozott sejthalálban döntő jelentőségű makromolekulák megismerése (1. ábra). Ez utóbbi téma fontosságát jól jellemzi, hogy az orvosi Nobel-díjat az idén éppen az e területen kutató fiziológusok (S. Brenner, H. R. Horvitz és J. E. Sulston) kapták. 

1. ábra. Három olyan fehérje, mely a kergemarhakórral (szarvasmarha-prionfehérje 23-230 [1dx0]), az Alzheimer-kórral (amiloid b-peptid [1bjb]), illetve a daganatos elváltozásokkal (P53 mutáns dimerizációs domén [1a1u]) kapcsolatos  
 

"…hogy egy még megdöbbentőbb csodát lásson, keresse a legkisebbet az ismert tárgyakban… és beleszédül a csodákba, mert a kicsinység csodája nem kisebb, mint a nagyság csodája. Mert ki ne ámulna el azon, hogy a testünk, mely észrevétlen a világban, láthatatlan a mindenségben, most egyszerre hatalmas kolosszussá lesz; új világ, vagy még inkább minden a semmihez képest, ahová el nem érhetünk…"

 
 Ha egy fehérjét azonosítani tudunk, akkor háromdimenziós szerkezetét is ismerjük? 

 Ellentétben a kisméretű és gyakran viszonylag rögzített térszerkezetű szerves és szervetlen molekulákkal, a fehérjék – és általában a makromolekulák – háromdimenziós szerkezete a meghatározott molekulatömeg, illetve a molekulákat felépítő fragmensek ismeretéből nem következik. A fehérjék térszerkezetének atomi szintű meghatározása tehát igen fontos feladat, amelyhez röntgen- vagy neutrondiffrakciós módszert, illetve mágneses magrezonancia- (angolul Nuclear Magnetic Resonance, röviden NMR-) spektroszkópiát használnak. Mivel az utóbbi módszer nem igényel kristályos halmazállapotú mintát, melynek előállítása a makromolekulák esetén sohasem egyszerű feladat, az utóbbi tizenöt évben az NMR-spektroszkópia kiemelt figyelmet kapott. Ma egy fehérje akár pár száz mikroliter, millimólos koncentrációjú oldatának NMR-spektroszkópiai analízisét követően képesek vagyunk meghatározni a fehérje oldatbeli térszerkezetét, még ha több ezer atomból áll is a molekula. Ugyanezzel a módszerrel információt gyűjthetünk a biológiai szempontból fontos molekula belső mozgásairól, esetleges átrendeződéseiről, szupramolekuláris komplexeiről. Tehát Kurt Wüthrich és munkatársai, valamint más kutatók olyan módszertani fejlesztéseket végeztek, amelyek segítségével ma már nemcsak kristályos halmazállapotban, hanem a fiziológiás körülményeknek jobban megfelelő oldatfázisban is megoldható a fehérjék térszerkezetével kapcsolatos mérések egész sora. Ezen eredmények jelentősége csak Max Perutz munkásságához hasonlítható, aki 1962-ben kapott Nobel-díjat az első, szilárd fázisú fehérje térszerkezet-meghatározását követően.
 
 Mi a makromolekuláknál használt tömegspektrometriai eljárások lényege? 

 Ez az eljárás az előző évszázad hajnalán született, amikor J. J. Thomson a neonizotópokat (²⁰Ne és ²²Ne) tanulmányozta. Az ionizációt követő pozitív töltésű gázionokat (²⁰Ne⁺ és ²²Ne⁺) elektromos térben felgyorsította, majd az ionokat adott mágneses téren átvezetve megfigyelte, hogy eltérő röppályát követnek, s így a detektorba eltérő helyeken csapódnak be. Szerencsés esetben a megfelelő energiájú elektronnyaláb által bombázott mintából ionok keletkeznek, amelyek azután molekulatömeg/töltés (m/z) értékeik alapján elkülöníthetők. Szemléletes hasonlatként gondoljunk például arra, hogyan választották szét boronálás után a gabonaszemeket az ocsútól: a keveréket a levegőbe „röpítették”, amelyből a szél elfújta a kisebb tömegű ocsút, míg a nagyobb tömegű gabonaszemek visszahullottak a földre. 

 Mivel a kisebb molekulatömegű és illékonyabb vegyületek tömegspektrometriás analízise könnyebben megoldható feladat volt, az első tudományos sikerek ezen a téren születtek. A nagyobb molekulák (pl. fehérjék) és a bomlékonyabb vegyületek eredményes MS-analízisére hosszabb időt kellett várni. A fejlesztők célja az volt, hogy olyan újabb ionizációs eljárásokat dolgozzanak ki, melyek még a nagy vákuumban is csak kevéssé illékony, de igen bomlékony makromolekulákból ionizált, gázfázisú és ép molekulaionokat eredményeznek. A gyors atomos bombázáson alapuló eljárás, az úgynevezett „Fast Atom Bombardment” (FAB), már alkalmas erre a célra. Az 1980-as évek eleje óta rutinszerűen használják például hosszabb peptidek vagy fehérjetöredékek tömegének meghatározására. Ígéretes kezdeményezésnek bizonyultak továbbá a plazmadeszorpciós (PD-), illetve lézerdeszorpciós ionizációs (LDI-) eljárások. Ezekkel a módszerekkel jelentős előrelépést mégsem sikerült elérni a biomolekulák 5000 vagy ennél is nagyobb molekulatömegű tartományában. Az 1980-as évek második felétől Hillenkamp, Karas és Tanaka - egymástól függetlenül - úgy fejlesztette tovább az LDI-technikát, hogy nem a vizsgálni kívánt molekulát, hanem a mintában levő hordozómátrixot gerjesztette lézersugárral. A mátrix- vagy hordozódeszorpción alapuló ionizációs eljárást (MALDI) kifejlesztve a vizsgálható molekulák mérettartománya ugrásszerűen megnőtt. Mivel ebben az esetben a lézersugárral a mátrix alkotóit bombázzuk, a célmolekulát csak áttételesen ionizáljuk, illetve párologtatjuk el. A folyamat mechanizmusa még ma sem teljesen tisztázott, ezért az eljárás kulcsfontosságú része a helyesen megválasztott hordozómolekula vagy mátrix. Ma elsősorban a szerves hordozók (pl. fahéjsav) használata terjedt el. 

2. ábra. A minta ionizációjának sematikus rajza a MALDI MS- (a) és az ESI MS- (b) eljárások során  
 

 Így leggyakrabban a nagyméretű makromolekulák, illetve a szupramolekuláris komplexek proton- (H⁺) vagy ion- (Na⁺, K⁺) adduktjai képződnek. Hasonlóan fontos felfedezés volt az elektroporlasztás (electrospray ionization, röviden ESI) mint ionizációs forrás kifejlesztése, ami elsősorban John B. Fenn nevéhez fűződik. A két eljárás (2. ábra) közös előnye, hogy akár több százezres molekulatömegű makromolekulák molekulatömegének meghatározását teszi lehetővé, közel femtomól (10^-15 mól), néha attomól (10^-18 mól) kimutatási határig. A korábbi eljárásoktól eltérően tehát mind a MALDI MS, mind az ESI MS elég érzékeny, és elég széles molekulatömeg-tartományban lehet velük mérni ahhoz, hogy akár nemkovalens biomolekuláris komplexek is vizsgálhatóvá váljanak. Ezek segítségével célfehérjékkel kölcsönható kofaktorok, inhibitorok, poliszacharidok, oligonukleotidok kutathatók. Idetartozik például a kalmodulin és egyes peptidkomplexei esetén a kalciumot kötő, illetve szabad formák ESI MS-analízise (Nemirovsky, 1997; Veenstra, 1998; Hill, 2000). Hasonlóan érdekes és jelentős terület a fehérjék és nukleinsavak kölcsönhatásának tanulmányozása. Fontos például megemlíteni, hogy ESI-MS-módszerek segítségével vizsgálhatók például a represszor fehérjék (Potier, 1998) vagy a ligandfüggő transzkripciós faktorok (Craig, 1999) DNS-komplexei. A teljesség igénye nélkül több hazai műhely munkájára is érdemes felhívni a figyelmet: Medzihradszky Katalin és Janáky Tamás (proteom-térképezés és fehérjék azonosítása; Szeged), Dinya Zoltán és Kéki Sándor (szerves molekulák és polimerek; Debrecen), Vékey Károly (az ESI- és a MALDI-mechanizmus vizsgálata, az ES továbbfejlesztése, peptidek, fehérjék glikoproteinek azonosítása és szerkezetvizsgálata; Budapest) és Juhász Gábor (neuroproteomika, neurodegeneráció; Budapest). Az említett kutatók csoportjainak munkája több szálon is kapcsolódik a nemzetközi élvonal kutatási területeihez. 

3. ábra. Emberi gyomorból származó fehérje izolálása, majd annak azonosítása a „feltárást” követő MALDI MS-analízis és az adatbázis összevetése alapján 
 

Egy példán keresztül érdemes bemutatni, hogyan használható a proteomika korában a MALDI-tömegspektrometria. Egészséges, illetve valamilyen betegségben szenvedő emberek gyomrából izolált fehérjék vizsgálata során koreai kutatók (Ha és munkatársai, 2002-ben)  kombinált vagy egyszerű MS-eljárással azonosítottak diagnosztikus fehérjéket (3. ábra). Az először „feltárt”, majd 2D-gélelektroforézissel szétválasztott, vízoldható fehérjekeverék megfelelő komponenseit analizálták. A kissé átfedő pH 4-7 és a pH 6-9 tartományok mindegyikében 600-900 eltérő méretű, illetve izoelektromos pontú fehérje foltját lehetett azonosítani. A beteg és az egészséges egyedek elektroforetikus képeinek különbözősége utalhat a betegséggel közvetlenül kapcsolatba hozható fehéréjére vagy fehérjékre. Ezeket a gélből egyesével izolálva, majd proteolitikusan hasítva (pl. tripszines vagy kimotripszines kezeléssel) MS-re alkalmas mintát kaphatunk. A fehérje már említett részleges emésztésével nyert fragmensek (polipeptidek) tömegspektrometriás módszerek (elsősorban MALDI MS) alkalmazásával azonosíthatók. Ez utóbbinak alapja a már ismert fehérjék különböző adatbázisokban tárolt „emésztési képeinek” MS-adatai. Ilyen típusú vizsgálatok a közeljövőben rutineljárássá válhatnak, aminek alapján a betegségek diagnózisa és a személyre szabott gyógyítási protokollok kialakítása eredményesebb lehet a ma alkalmazott beavatkozásokhoz képest. 

"Mert mi az ember a természetben? Semmi a végtelenhez képest, minden a semmihez képest. Valami a semmi és a minden közt, a közepén…Két végtelen közé szorítva élünk, ez a mi világunk, s így minden lépésünk középszerű és szűk korlátok közé szorul…"

 Láttuk, hogy egyes esetekben a makromolekulák szerkezete röntgendiffrakciós eljárással meghatározható. Ha ez így van, miért fontos az NMR-spektroszkópia, és mi az alapja? 

 Mielőtt erre a kérdésre válaszolnánk, érdemes az NMR-spektroszkópia alapjelenségét feleleveníteni. Az eljárás lényegét Bloch és Purcell (1946) figyelték meg először, akik észrevették, hogy egyes atommagok (pl. ¹H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁹F, ³¹P) rájuk jellemző módon, külső mágneses tér jelenlétében képesek a rádiófrekvenciás tartományban energiát elnyelni, s így sajátságos rezonanciajelenséget mutatni. Kezdetben talán nem is gondolták a kutatók, hogy egyszer ez az eljárás az atomszintű szerkezetkutatás fontos pillérévé nőheti ki magát. Az 1950-es években megfigyelték (Proctor és Yu), hogy a rezonanciafrekvencia nagysága (n₀) nemcsak a külső mágneses tér nagyságával (B₀) arányos, hanem érzékeny az egyes magok molekuláris környezetére is. Az utóbbi jelenség felelős elsősorban a rezonanciafrekvenciák kémiai környezettől való függéséért, röviden a jelek diszperziójáért. A rezonanciafrekvenciák egy további érdekes sajátsága a "spin-spin" csatolás okozta finomszerkezet. Összefoglalva: az NMR-jelek "egyedi jellegét" a mágnesesen aktív magok molekulán belüli egyedi elhelyezkedése, a spin-spin csatolás jelensége és a relaxációs tulajdonságok együttese határozza meg. Az elmúlt évtizedben jelentős előrelépés volt például a Fourier-technika, a nagy felbontású oldatfázisú NMR-, illetve szilárdtest-NMR-spektroszkópia, a többdimenziós NMR-spektroszkópia vagy az NMR-képalkotás előbb elméleti, majd gyakorlati megalapozása. Fontos továbbá megemlítni, hogy a molekuláris biológia fejlődése, a géntechnológiai eljárások elterjedése, illetve a stabil, nem sugárzó izotópok biomolekulákba (elsősorban fehérjékbe) történő beépítése mind döntő módon járult hozzá a ma használatos bio-NMR-spektroszkópia megszületéséhez. 

Mi lehet a magyarázata annak, hogy a sokrétű kutatás és fejlesztés eredményei ellenére egyre nagyobb és nagyobb mágneses térerejű készülékeket forgalmaznak?

A nagyobb mágneses térerő (B₀) nagyobb rezonanciafrekvencia-értéket (n₀) és a B₀-val csaknem lineárisan növekvő jelfelbontást, illetve a B₀^3/2 szerint növekvő érzékenységet eredményez. Eszerint 600-ról 750-MHz-re áttérve a felbontás körülbelül 25%-ot, az érzékenység akár 40%-ot is nőhet. Éppen ezért érthető, hogy a szupravezető mágnesek fejlesztése továbbra is szakadatlanul folyik. Az 1990-es évek közepétől megjelenő 750 MHz-es (B₀= 17,5 tesla), illetve a napjainkban megszülető 900 MHz-es (B₀ = 21,15 tesla), a szerkezetkutatásban rutinszerűen használható készülékek jól tükrözik a legfejlettebb laboratóriumok lehetőségeit. Itt érdemes megemlíteni, hogy az EU-országokban már egy-két évvel ezelőtt is több mint 30 nagy terű (700-800 MHz-es) spektrométer üzemelt, míg hazánkban ma a legnagyobb készülék mindössze 500 MHz-es. 

Az első egydimenziós felvételek egyike a ribonukleáz 40 MHz-es (1 tesla) térerőnél negyvenöt évvel ezelőtt felvett protonspektruma volt. A molekulában lévő sok száz proton rezonanciaferkvenciája mindössze négy kiszélesedett sávot alkot (Saunders és munkatársai, 1957). A ma már 18,8 tesla térerőt is meghaladó készülékek (>800 MHz) korában ugyanaz az egyszerű 1D protonspektrum (1H-NMR) részletgazdagsága összehasonlíthatatlanul nagyobb, bár a legtöbb protonjel ennél a térerőnél is lényeges átfedést mutat (4. ábra).

4. ábra. Egy kisméretű fehérje ¹H-NMR-spektrumának aromás és amid protontartománya. A jelek erőteljes átfedést mutatnak  
 

Hogyan lehet a fehérjék és a makromolekulák NMR-jeleit azonosítani és feldolgozni, ha a jelek többsége az egydimenziós spektrumokban nem különíthető el?

A megoldást nem a térerő mindenáron való növelése jelenti, mely amúgy is komoly korlátokba ütközik, hanem az úgynevezett pulzusszekvenciák céltudatos és sokszor igen szellemes alkalmazása. A pulzusszekvenciák bevezetése, illetve azok alkalmazási területeinek akár kivonatos ismertetése túlhaladná ennek az írásnak a kereteit, ezért inkább egy egyszerű kép segítségével érdemes a problémát megvilágítani. Egy adott külső mágneses térerő mellett a rezonanciakísérlet létrehozásához szükséges gerjesztő vagy rádiófrekvenciás impulzus hatására a spinek állapota megváltozik. Az adatgyűjtés során a jelenség időbeli lecsengését figyeljük meg. Ha az említett impulzus és az azt követő adatgyűjtés közé, megfelelő időközökben, újabb impulzusokat, illetve adott időtartamú szüneteket helyezünk el, akkor azok tovább módosítják a spinek állapotait, és e módosítások "nyoma" az adatgyűjtés során rögzíthető. A spineket tehát meg lehet "táncoltatni", szigorú táncrend szerint, ahogy arra szellemesen Ray Freeman könyvének címében a "spinkoreográfia" is utal. Különböző táncrendek különböző módon árulkodnak a spineknek molekulán belüli kapcsolatairól, és így, nem kevés vesződés után, a spinek egymással alkotott kapcsolata, egymáshoz viszonyított térbeli helyzete feltérképezhető. 

"Ilyenek vagyunk hát, ezért állunk egyaránt távol a teljes tudástól és a teljes tudatlanságtól. Középen úszunk hatalmas, bizonytalan, hullámzó tömegen az egyik véglettől a másik felé. Ha egy szilárd ponthoz akarunk rögződni, a talaj meginog és kicsúszik alólunk. Ha tovább keresünk, mindig újból és újból kisiklik a lábunk alól, menekül, örökösen menekül előlünk. A mi számunkra semmi sem állandó…"

A korszerű bio-NMR-spektroszkópia lényege az összetett és bonyolult pulzusszekvenciákban gyökeredzik?

Hatalmas a megtett út, az első homonukleáris korreláción alapuló spektrumokat eredményező pulzusszekvenciák alkalmazása óta. Jól érzékelhető a fejlődés, ha ezeket a mindössze két-három pulzusból álló egyszerű szekvenciákat összevetjük egy-egy, manapság használatos bonyolultabb, úgynevezett heteronukleáris pulzusszekvenciával, amely akár 30-50 elemből is felépülhet (5. ábra). A több és több pulzusból álló, több csatornán végzett, összetett lecsatolásokat alkalmazó, speciális gradiensszelekciókon alapuló eljárások mind arra hivatottak, hogy a "jól feltett kérdésekre" a kísérlet során a lehető legteljesebb választ adják. Ezek a fejlesztések mérföldkőnek számítottak, amit az is bizonyít, hogy az 1990-es évek elején a korszerű NMR területén tett felfedezéseiért Richard R. Ernst kapta a Nobel-díjat. 

5. ábra. Egy egyszerű 2D-homonukleáris (COSY) és egy lényegesen összetettebb 3D-heteronukleáris (HNCA) korrelációs pulzusszekvencia. Mindkét pulzusszekvenciát előszeretettel használják a fehérjék NMR-jeleinek azonosítására

Hála a növekvő térerőnek (B₀) és az egyre összetettebb pulzusszekvenciák alkalmazásának, kiderült, hogy az NMR-spektroszkópia érzékenysége lehetővé teszi, hogy az egyes aminosavakhoz tartozó spinrendszereket elkülönítve lássuk, és így azokat azonosítani tudjuk. Mindez azt jelenti, hogy nemcsak az eltérő, hanem az azonos aminosavak jelrendszerei is elkülönülhetnek egy fehérjében, ha azok kémiai környezete elegendően különböző. Ennek köszönhetően akár sok száz rezonanciafrekvencia is hozzárendelhető a fehérje sok száz atomjához, röviden a jelek asszignációja megoldható. 

„Az ember gondolja meg, mi ő a mindenséghez képest; lássa magát a természet egy félreeső kis zugában, és ebben a kis börtönben, azaz a világban ismerje meg a föld, a királyságok, a városok és önmaga igazi értékét. Mert mi az ember a végtelenben?”

Felvetődhet a kérdés, hogy valójában a kezdeti és legfőbb cél nem egy vagy több NMR-spektrumban szereplő jel azonosítása volt, hanem a makromolekula térszerkezetének meghatározása. Hogyan lesz tehát az asszignált NMR-spektrumból fehérje-térszerkezet? 

Ennek megvilágításához még egy fontos alapjelenségre kell utalnunk. Már az NMR-spektroszkópia születését (1955) követő első években megfigyelték, majd megmagyarázták a felfedezőjéről elnevezett Overhauser-effektust. Eszerint az NMR-jel intenzitása megnőhet, ha olyan jelet sugározunk be, amely a molekula egy másik spinjéhez tartozik. A nukleáris Overhauser-effektus (röviden NOE) a szerkezetkutatók kezében alapvető eszközzé vált, mivel ennek segítségével az egymástól 3-6 Ĺ-nél nem távolabbi spinek kölcsönösen azonosíthatók. Ez a kísérlet döntő fontosságú a szerkezetkutatásban, hiszen segítségével a molekulában fellelhető belső távolságok becsülhetővé válnak. Az NOESY (Nuclear Overhauser Exchange Spectroscopy) típusú mérésekre (6. ábra) épülő szerkezetmeghatározás a gyűjthető távolságok alapján bonyolult, iteratív eljárás, amelyben – a mért NOE-típusú adatok alapján – a molekulát felépítő protonok távolságadatait mint kényszerfeltételeket használjuk. Itt jegyezzük meg, hogy más típusú mérési adatokból (csatolási állandók, hőmérsékleti koefficiensek stb.) további kényszerfeltételek vonhatók be a szerkezetmeghatározás folyamatába. 

6. ábra. Egy kisméretű fehérje NOESY-spektruma

"Minden ok és okozat; közvetett és közvetlen egyaránt. Természetes, láthatatlan kötelék köti össze a legtávolabb eső, a legkülönbözőbb dolgokat. Lehetetlen a részeket az egész nélkül megismerni, és nem ismerjük az egészet addig, amíg minden részt egyenként nem ismerünk…"
 

Miként  összegezhető az idei Nobel-díjas Kurt Wüthrich munkáságának lényege?

A fehérjék első szisztematikus NMR-szerkezetvizsgálata az ő és munkatársai nevéhez fűződik. Kevéssel több mint 15 éve a svájci csoport munkatársai rámutattak arra, hogy mind a polipeptidek, mind a fehérjék esetében a jelhozzárendelés elvi lehetősége adott. Az aminosavak NMR-jelrendszerei (az úgynevezett spinrendszerek) azonosíthatók, valamint azok szekvenciális összerendezése NMR-kísérletek révén megoldható. Így az 1980-as évek végére a fehérjék térszerkezete nemcsak szilárd, hanem oldatfázisban is feltérképezhetővé vált. Ezzel Wüthrich és kollégái megteremtették az ab initio bio-NMR-szerkezetkutatást (Wagner és Wüthrich, 1982). Az ő érdemük tehát az a kijelentés, hogy a fehérje primer szekvenciájának ismeretében a bonyolult NMR-jelek azonosíthatók. Ők mutattak rá először arra is, hogy - a fehérjék kompakt jellegéből következően - a már említett NOE-típusú kísérletek segítségével olyan nagyszámú, molekulán belüli távolságadat gyűjthető (Havel és Wüthrich, 1985), hogy végeredményben a fehérjék oldatbeli konformációja kiszámíthatóvá válik. Hogy ez a stratégia eredményre vezet, azt bizonyítja az első, NMR-alapon meghatározott fehérjeszerkezet (7. ábra, Williamson és munkatársai, 1985). Így tehát elvi jelentőségű volt egy inhibitorfehérje (BUSI IIA) 3D térszerkezetének meghatározása elsőként. 

7. ábra A BUSI IIA inhibitorfehérje térszerkezetének vázlatos rajza (1BUS)

Mi az NMR-alapú fehérjeszerkezet-meghatározás előnye és mik a módszer korlátai?

Napjainkban a 12-18 tesla mágneses térerejű készülékek lehetővé teszik a 20000-40 000 molekulatömegű fehérjék oldatfázisú térszerkezetének azonosítását. Ez a mérethatár a röntgenkrisztallográfia alkalmazása esetén lényegesen nagyobb. A makromolekulák, s ezen belül a fehérjék NMR-spektrumán alapuló szerkezetkutatás számos előnye közül ugyanakkor érdemes megemlíteni azt, hogy a méréseket vizes oldatban végzik, ami a fiziológiás körülményeket jól modellezheti. Ismételten utalnunk kell azonban arra, hogy az NMR-alapú fehérjeszerkezet-kutatás egyik legsúlyosabb korlátozó tényezője a molekula mérete. Míg az 5000-8000 molekulatömegű mérethatárig a fehérjék szerkezetvizsgálata - az ¹H-NMR-spektrumok analízisén keresztül - az úgynevezett homonukleáris mérések alapján megoldható, addig a legkorszerűbb ¹³C-, ¹⁵N-, ²H-stratégia alkalmazása esetén is csak a körülbelül 50 000-es molekulatömegnél kisebb fehérjék térszerkezetének meghatározására van esély. Ráadásul e méretkorlát oka elsősorban a molekula relaxációs tulajdonságaival magyarázható. Ez az akadály a közeljövőben sem tűnik egyszerűen leküzdhetőnek. Bár az 1990-es évek második felétől egyre népszerűbbek a TROSY- (Transverse Relaxation Optimization Spectroscopy) típusú mérések, amelyek alapgondolata ugyancsak a Wüthrich-laboratóriumból származik, a molekulák mérete mégis alapvetően meghatározza az NMR-rel tanulmányozható molekulák körét. Mindazonáltal ugyanezen metodika keretei között a makromolekulák szerkezetvizsgálatát kiegészítő dinamikai paraméterek, az esetleges konformációs egyensúlyok és cserélődések eredményesen kutathatók. 

Ha mindössze az NMR különböző alkalmazási területeinek címszavait gyűjtjük össze, már akkor is szép csokorra valót találunk: biológiai, illetve mesterséges membránok és membránfehérjék szerkezetvizsgálata, diffúziós NMR-spektroszkópia, "in situ" reakciókövetés szilárd fázisú szintézisek során, kombinatorikus kémiai alkalmazások, kromatográfiás ejárásokkal kombinált NMR-módszerek (pl. LC+NMR, kapilláris HPLC+NMR stb.), tömegspektrometriával bővített NMR (pl. LC-NMR-MS). Összefoglalásként és egy korábban feltett kérdésre válaszolva azt mondhatjuk, hogy a röntgendiffrakción és az NMR-spektroszkópián alapuló atomi szintű szerkezetkutató módszerek nem konkurensei egymásnak, hanem inkább egymást komplex módon kiegészítő megközelítések, amelyek meghatározzák a szerkezeti biokémia viszonylag új kutatási területeinek fejlődését. 

Bár a hazai NMR-es kutatócsoportok száma jelentős, és a bio-NMR területén kiváló és nemzetközi szinten is ismert kutatók dolgoznak (Szilágyi László, Kövér Katalin, Batta Gyula), a lehetőségek az ideálistól mégis elmaradnak. Ennek egyik magyarázata az, hogy jelenleg Magyarországon kevés az olyan NMR-spektrométer, amely nagyméretű biomolekulák szerkezetvizsgálatára alkalmas. Jelenleg ilyen irányú kutatások a Debreceni Egyetem, illetve az Eötvös Loránd Tudományegyetem szerves kémiai tanszékein folynak. Mivel a hazai műszerezettség csúcsát az 500 MHz-es készülékek jelentik, az ezen a térerőn nem megoldható kutatási problémákat csak külföldi együttműködések keretében lehet  vizsgálni. A világban ma a biokémiai kutatások egyik meghatározó iránya a nagyméretű biopolimerek (fehérjék, nukleinsavak) szerkezetvizsgálata, ugyanakkor Magyarországon csupán néhány éve léteznek olyan kutatóhelyek, amelyek erre alkalmasak. A "boldogsághoz" nem, de a továbblépéshez egy sor feltétel megteremtése mellett szükséges volna egy, a hazai biomolekuláris szerkezetkutatást lehetővé tevő, nagy terű (700-800 MHz) NMR-készülékkel felszerelt laboratórium létesítése. 

"…Az ember számára az ember a természet legmegfoghatóbb csodája; mert képtelenek vagyunk felfogni, mi a test és még kevésbé értjük, mi a szellem, és azt értjük a legkevésbé, hogy egyesülhet a szellem a testtel. Ez számunkra a legeslegnagyobb talány, pedig ez az ember lényege."

----------------------------------------------------------------
Kislexikon 

Represszor fehérje: olyan fehérje, amely egy adott gén kifejeződését (átírását) gátolja úgy, hogy a DNS-molekula megfelelő szabályozószakaszához kötődik.

Transzkripciós faktor: egy (vagy több) gén kifejeződését (átírását) szabályozó fehérje; a DNS-molekula megfelelő szabályozórégiójához köt. Ligandfüggő transzkripciós faktorról akkor beszélünk, ha közvetlenül ez a fehérje az, amelyik a szabályozási folyamatban kulcsszerepet játszó kis molekulát (pl. glükózt, anyagcsere-köztitermékeket stb.) felismeri, és ennek hatására köt (vagy nem köt) a DNS-molekulához.

Inhibitor: egy adott enzim működését gátló molekula; lehet fehérje vagy egyéb kémiai természetű anyag.

Kofaktor: egy adott fehérje (enzim) működéséhez szükséges nem fehérje természetű molekula. 

Proteomika: az élőlények fehérjekészletének (funkcionális, szerkezeti stb.) feltérképezését célul kitűző tudományág. A genomika (az élőlények teljes genetikai anyagával foglalkozó tudomány) szó mintájára alkották meg.

Elektroforézis: fehérjék elválasztására és azonosítására használt analitikai eljárás; alapja, hogy elektromos térben a különböző méretű és töltésű molekulák eltérő sebességgel vándorolnak a megfelelő pólusok irányába.

Homonukleáris korreláció: egy molekulában az azonos atommagok között meglévő kölcsönhatáson alapuló, NMR-spektroszkópiával mérhető kapcsolat. 

Lecsatolás: az az eljárás az NMR-spektroszkópiában, amikor adott magokat/magfajtákat folyamatos gerjesztéssel telítésbe viszünk, így azok más magokra gyakorolt hatásai (pl. jelfelhasadás) nem jelennek meg a spektrumban.

Gradiensszelekció: az NMR-mérés során a mágneses tér irányítottan befolyásolt inhomogenitását kihasználó módszer.